JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:00 min • July 8th, 2025
La glicogeno sintasi – un enzima cruciale nella sintesi del glicogeno – scinde il glucosio uridina difosfato, o UDP-glucosio – uno zucchero nucleotidico – in UDP e residuo glicosile e aggiunge il monomero di glucosio rilasciato alla catena del glicogeno in crescita.
Per stimare l'attività della glicogeno sintasi, iniziare assumendo una miscela di reazione contenente glicogeno, UDP-glucosio, ATP, fosfoenolpiruvato e nicotinammide adenina dinucleotide, o NADH, in una provetta. Aggiungere l'enzima nucleosidico difosfato, o NDP, e un cocktail di enzimi piruvato chinasi e lattato deidrogenasi. Mescolare il contenuto e incubare.
Aggiungere un campione contenente glicogeno sintasi alla provetta per avviare la reazione enzimatica.
La glicogeno sintasi agisce sull'UDP-glucosio, generando UDP e un residuo glicosilico. L'enzima assorbe il monomero di glucosio libero e lo incorpora nella catena di glicogeno della miscela di reazione. In presenza di ATP, la chinasi NDP della miscela di reazione fosforila l'UDP inutilizzato, convertendolo in UTP e generando ADP.
L'enzima piruvato chinasi agisce sull'ADP e aggiunge un fosfato donato dal fosfoenolpiruvato della miscela di reazione per produrre ATP e piruvato. Successivamente, la lattato deidrogenasi converte il piruvato in lattato e ossida il NADH durante la reazione.
Misurare la diminuzione dell'assorbanza del NADH a 340 nm per quantificare la quantità di NADH consumata, che indica il successo dell'attività enzimatica.
Per iniziare con la determinazione dell'attività della glicogeno sintasi, scongelare le soluzioni madre precedentemente preparate di UDP-glucosio, ATP, fosfoenolpiruvato e NDP chinasi su ghiaccio. Preriscaldare un bagnomaria a 30 gradi Celsius.
Quando le soluzioni madre sono pronte, preparare una miscela di analisi sufficiente in base al numero di saggi di glicogeno sintasi, aggiungendo i reagenti a una provetta da 15 millilitri, come descritto nel protocollo di testo.
Preparare una reazione in bianco sostituendo il NADH della miscela di reazione con l'acqua e trasferire la reazione in una cuvetta di metacrilato usa e getta. Utilizzare la reazione in bianco per impostare 'Zero' sullo spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 340 nanometri.
Prendere un'aliquota da 770 microlitri della miscela di reazione in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere in sequenza 2 microlitri ciascuno di NDP chinasi e miscela di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi alla provetta.
Dopo aver mescolato delicatamente, incubare la provetta a 30 gradi Celsius a bagnomaria, per 3 minuti per preriscaldare la miscela di reazione. Quindi, aggiungere 30 microlitri del campione contenente glicogeno sintasi, in tampone Tris da 20 millimolari a pH 7,8, e mescolare delicatamente prima di trasferire la miscela di reazione in una cuvetta monouso di metacrilato.
Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro e registrare l'assorbanza a 340 nanometri a intervalli cronometrati per 10-20 minuti. Quindi, traccia le assorbanze ottenute rispetto al tempo.