JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:00 min • July 8th, 2025
Durante l'infezione da virus influenzale, il virus entra nella cellula attraverso l'endocitosi e dirotta il macchinario della cellula ospite, producendo virioni progenie. Questi vengono rilasciati, infettando le cellule vicine, causando una cascata di infezioni.
Per misurare il rapporto virus/cellule dell'influenza infettiva in coltura - molteplicità dell'infezione - aggiungere una densità appropriata di sospensione di cellule di mammifero appena ottenuta in una piastra per microtitolazione.
La piastra contiene microelettrodi d'oro per la misurazione dell'impedenza incorporati nel fondo del pozzetto. Incubare, consentendo alle cellule di aderire al fondo del pozzetto e raggiungere la fase di crescita esponenziale prima dell'infezione.
Applicare un piccolo potenziale elettrico tra i microelettrodi. Le celle aderenti ai microelettrodi fungono da isolanti, limitando il flusso di corrente e aumentando la resistenza elettrica (impedenza) che viene misurata.
Rimuovere il supporto. Pipettare la sospensione del virus dell'influenza nei pozzetti. Integrare con un'endoproteasi serina adatta.
Durante l'incubazione, la serina endoproteasi scinde e attiva la glicoproteina virale emoagglutinina, facilitando il suo legame con specifici recettori della cellula ospite e il successivo ingresso nella cellula virale.
Utilizzando il macchinario della cellula ospite, vengono prodotte e rilasciate nuove particelle virali, infettando le cellule vicine. Di conseguenza, le cellule infettate dal virus subiscono cambiamenti morfologici e mostrano effetti citopatici, portando alla morte cellulare: le cellule si staccano dalla superficie del microelettrodo, diminuendo l'impedenza nel tempo.
Determinare il tempo impiegato affinché l'impedenza si riduca alla metà dell'impedenza iniziale prima dell'aggiunta del virus. Un lasso di tempo più breve suggerisce una maggiore molteplicità di infezioni virali.
Per determinare la correlazione tra i valori CIT50 e la molteplicità dell'infezione, dopo aver coltivato 3 x 104 cellule MDCK appena divise in ciascuna parete della piastra elettronica per microtitolazione per 24 ore, lavare le cellule due volte con 100 microlitri di terreno di propagazione del virus fresco per pozzetto per lavaggio e utilizzare una pipetta a canale singolo per aggiungere 100 microlitri di sospensione virale a ciascun pozzetto.
Quando tutte le diluizioni del virus sono state aggiunte, caricare delicatamente la piastra nella tasca della culla dello strumento a 35 gradi Celsius e iniziare a monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti per almeno 100 ore, come dimostrato.
Dopo due cicli di misurazioni, fare clic per "Mettere in pausa" l'apparecchio e rimuovere la piastra E dalla base. Aggiungere 100 microlitri di terreno di propagazione del virus integrato con TPCK-tripsina a ciascun pozzetto e rimettere la piastra E-plate nella tasca della culla. Quindi, avvia l'analisi.