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Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:52 min • July 8th, 2025
I virus si legano al recettore della cellula ospite e si internalizzano in un endosoma. La membrana endosomiale si fonde con la membrana virale, rilasciando contenuti virali all'interno della cellula.
Una volta raggiunto il nucleo, il genoma virale si trascrive in mRNA e successivamente si traduce per formare proteine virali. I componenti virali entrano nel citoplasma e si assemblano in virioni, che escono dalla cellula e causano effetti citopatici: cambiamenti nella morfologia della cellula ospite e morte.
Per valutare la cinetica di sopravvivenza del virus misurando l'impedenza della cellula ospite, prelevare una piastra multipozzetto rivestita con microelettrodi per la misurazione dell'impedenza nella parte inferiore. Aggiungere una sospensione di cellule ospiti ai pozzetti e incubare per consentire alle cellule di aderire alla superficie dell'elettrodo e crescere.
Successivamente, assumere sospensioni virali pretrattate con soluzione salina con diverse cariche virali. Il trattamento salino fornisce al virus cloruro, che produce acido ipocloroso che lo uccide, riducendo l'infettività virale. Aggiungere queste sospensioni virali nei rispettivi pozzetti.
Misurare l'impedenza cellulare – un fenomeno di opposizione al flusso di corrente elettrica attraverso gli elettrodi – da parte delle celle aderenti.
I virus infettano le cellule ospiti aderenti e ne modificano la morfologia, causando il distacco delle cellule trasformate dagli elettrodi. Nel tempo, man mano che più cellule vengono infettate, l'impedenza cellulare mediata dalla cellula ospite diminuisce.
Traccia l'indice cellulare, che è la variazione dell'impedenza dovuta al distacco di cellule infette, nel tempo.
Per valutare la cinetica di sopravvivenza del virus dell'influenza A, aggiungere cloruro di sodio a una concentrazione finale di 35 grammi per litro in acqua distillata e aggiungere 900 microlitri della soluzione salina risultante a criotubi da 2 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di stock virale a ciascuna crioprovetta e posizionare le provette nell'incubatore a 35 gradi Celsius, per il periodo di tempo sperimentale appropriato.
Il giorno prima della fine dell'incubazione, seminare 3 x 104 cellule MDCK appena divise in 100 microlitri di terreno di propagazione del virus per pozzetto, in una piastra per microtitolazione a 16 pozzetti, e ripetere i passaggi consentendo di misurare l'impedenza di fondo e la distribuzione uniforme delle cellule sul fondo dei pozzetti. Quindi, fai crescere le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, lavare le cellule due volte, quindi infettare le cellule con 100 microlitri di virus distillato in soluzione salina, diluito 10 volte in terreno di coltura fresco, come dimostrato, e monitorare l'impedenza cellulare ogni 15 minuti per almeno 100 ore.