Dosaggio delle sostanze reattive all'acido tiobarbiturico per valutare lo stress ossidativo nel siero umano

Le cellule generano bassi livelli di radicali liberi durante i processi metabolici.

In condizioni patologiche, si verifica una sovrapproduzione di radicali liberi, causando stress ossidativo. Questi radicali liberi attaccano gli acidi grassi polinsaturi nei fosfolipidi della membrana cellulare in un processo chiamato perossidazione lipidica. Questo forma prodotti di ossidazione tossici, tra cui idroperossidi lipidici e malondialdeide (MDA), che causano danni alla membrana e morte cellulare.

Per rilevare lo stress ossidativo nel siero umano in vitro utilizzando il test della sostanza reattiva dell'acido tiobarbiturico (TBARS), iniziare con una provetta contenente siero umano trattato con un composto che induce l'ossidazione. Il siero trattato comprende principalmente prodotti di perossidazione lipidica - MDA e idroperossidi lipidici - insieme a fosfolipidi, lipidi e proteine.

Successivamente, aggiungi il dodecil solfato di sodio (SDS) e mescola per solubilizzare i lipidi e rilasciare l'MDA. La SDS denatura tutte le proteine contaminanti. Aggiungere un tampone acido adatto, seguito da acido tiobarbiturico acido (TBA). Incubare ad alta temperatura.

In condizioni acide e ad alte temperature, le molecole di TBA reagiscono con l'MDA, formando un complesso stabile rosso-rosa MDA-TBA, chiamato TBARS. Incubare su ghiaccio per fermare la reazione e stabilizzare i complessi esistenti.

centrifuga. Raccogliere e trasferire il surnatante contenente MDA-TBA in una piastra a più pozzetti. Utilizzando un lettore di micropiastre, misurare l'assorbanza del complesso.

Un'assorbanza più elevata suggerisce un'alta concentrazione di TBARS, che indica livelli più elevati di prodotti di perossidazione lipidica e stress ossidativo nel siero.

Etichettare le provette di vetro per i campioni da analizzare, quindi aggiungere 100 microlitri del campione preparato a ciascuna provetta. Aggiungere 200 microlitri di SDS all'8,1% a ciascun campione e agitare delicatamente il tubo di vetro con un movimento circolare per mescolare.

Aggiungere 1,5 millilitri di tampone acetato di sodio molare da 3,5 molari a ciascun campione. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di soluzione acquosa di acido tiobarbiturico allo 0,8%. Portare il volume finale in ogni provetta a 4 millilitri aggiungendo 700 microlitri di acqua deionizzata. Tappare bene i tubi di vetro e incubarli in un blocco riscaldante impostato a 95 gradi Celsius per 1 ora. Coprire i tubi con un foglio di alluminio per evitare la formazione di condensa. Quindi, rimuovere le provette dal blocco e incubarle sul ghiaccio per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni e gli standard a 1.500 x g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire 150 microlitri di surnatante da ciascuna provetta in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, rimuovendo eventuali bolle d'aria con un puntale per pipetta.

Misurare l'assorbanza dei campioni a 532 nanometri. Quindi, sottrarre la lettura media dell'assorbanza dei campioni bianchi da tutte le altre letture dell'assorbanza.

Crea una curva standard e usala per calcolare le concentrazioni di campioni sconosciute.