Saggio di germinazione delle coroidi per studiare la proliferazione microvascolare oculare ex vivo

0 visualizzazioni3:48 min • July 8th, 2025

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Nell'occhio dei mammiferi, la coroide, situata tra la sclera e la retina, contiene macrofagi perivascolari e coriocapillare, uno strato di capillari sanguigni rivestiti da periciti che fornisce ossigeno e sostanze nutritive alla retina. I vasi sanguigni anormali che spuntano dalla coriocapillare si verificano in diverse malattie oculari vascolari.

Per studiare la coriocapillare disregolata che germoglia ex vivo, prendere espianti di occhio di topo raccolti contenenti la coroide attaccata alla sclera e all'epitelio pigmentato retinico, o RPE.

Aggiungi goccioline di estratto di membrana basale, o BME, un idrogel arricchito in proteine della matrice extracellulare, ai pozzetti di una piastra a più pozzetti. Posizionare gli espianti nella gocciolina, evitando l'appiattimento dei tessuti. Lasciare che il BME si solidifichi.

Aggiungere terreno integrato con cellule endoteliali o fattori di crescita specifici per l'EC. Incubare. L'RPE secerne un fattore di crescita dell'endotelio vascolare che, insieme ai fattori di crescita specifici dell'EC, stimola la proliferazione dell'EC capillare.

Il BME solidificato forma una matrice extracellulare che promuove le EC proliferanti a formare tubuli capillari germoglianti. I periciti migrano e si attaccano a questi capillari germoglianti, facilitando la maturazione delle EC capillari.

I macrofagi attivati nella regione di germinazione secernono enzimi per digerire la membrana di Bruch, lo strato coroideale più interno, che consente ai germogli di migrare nell'RPE.

Al microscopio, visualizza i capillari che germogliano. Utilizzando un software adatto, misurare l'area coperta dal germoglio coroide.

Un'area di germinazione coroideale più ampia indica una progressiva germinazione coriocapillare nell'espianto.

Aggiungere 30 microlitri di BME scongelato al centro di ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Assicurarsi che la goccia di BME formi una cupola convessa nella parte inferiore della piastra senza toccare i bordi.

Posiziona il tessuto al centro del BME. Non appiattire l'espiantazione della coroide. Lascia che il tessuto si espanda all'interno del BME. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti per far solidificare il gel. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno classico completo in ogni pozzetto. Cambia il mezzo classico a giorni alterni.

La germinazione delle coroidi può essere osservata dopo tre giorni con un microscopio. Apri l'immagine della germinazione della coroide con l'immagine J e seleziona "Immagine | Tipologia | e 8 bit" con scala di grigi. Quindi ottimizza il contrasto selezionando "Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto" e regolandolo.

Utilizzare la funzione "Bacchetta magica" per delineare e rimuovere il tessuto coroide, che è presente al centro dei germogli. Rimuovi lo sfondo dell'immagine con gli strumenti di selezione gratuiti.

Quindi, vai su "Immagine | Regola | Soglia " e utilizzare la funzione "Soglia" per definire i germogli microvascolari sullo sfondo e sulla periferia. Fai clic su "F2" e apparirà un riepilogo. Fare clic su "Salva" per salvare un'immagine dell'area selezionata nella stessa cartella dell'immagine originale per riferimento futuro.

Dopo aver misurato un gruppo di campioni, copiare i dati registrati per l'analisi.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026