Reazione a catena della polimerasi a gradiente per determinare la temperatura di ricottura ottimale
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:30 min. • July 8th, 2025
La reazione a catena della polimerasi a gradiente è una tecnica per ottimizzare la temperatura di ricottura alla quale i primer - DNA a filamento singolo specifico per la sequenza - si legano ai siti complementari sul DNA stampo.
Prelevare una miscela contenente primer diretti e inversi, dNTP e DNA polimerasi termostabile in un tampone appropriato. Aggiungere il DNA stampo e trasferire i costituenti in una piastra PCR.
Posizionare la piastra in un termociclatore a gradiente con un blocco riscaldante specializzato. Ciò stabilisce un gradiente lineare di temperatura di ricottura compreso tra 55 °C e 65 °C, con un aumento costante della temperatura in tutta la lastra.
La reazione riscalda la piastra ad alta temperatura, denaturando il DNA a doppio filamento in singoli filamenti e attivando la DNA polimerasi. Successivamente, la temperatura viene abbassata in base ai valori programmati in ogni pozzetto, facilitando la ricottura del primer.
A una temperatura di ricottura inferiore a quella ottimale, i primer si legano in modo non specifico al DNA denaturato, portando a un'amplificazione non specifica durante la reazione di PCR. A temperature superiori a quelle ottimali, quantità insuffi
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici