JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 8:45 min. • July 8th, 2025
La reazione a catena della polimerasi digitale duplex (ddPCR) consente il rilevamento quantitativo simultaneo di due marcatori genetici distinti.
Per iniziare, prelevare un campione contenente due diverse sequenze target. Aggiungere una miscela contenente un enzima DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer specifici per il bersaglio. Successivamente, aggiungere due diverse sonde oligonucleotidiche specifiche per il bersaglio, etichettate con reporter fluorescenti e una molecola di quencher per rilevare bersagli amplificati.
La soluzione viene emulsionata con olio per suddividere le sequenze bersaglio in numerose nanogoccioline. Ogni gocciolina contenente il bersaglio agisce come un singolo recipiente di reazione.
Avviare il processo di ciclo termico per la reazione di amplificazione all'interno delle singole nanogoccioline.
Ad un'elevata temperatura di denaturazione, i bersagli a doppio filamento si separano in singoli filamenti.
Abbassare la temperatura per raggiungere la temperatura di ricottura appropriata, consentendo ai primer e alle sonde oligonucleotidiche di legarsi al modello.
La vicinanza del quencher sopprime la fluorescenza del reporter. Alla temperatura di estensione,
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici