PCR digitale duplex per la quantificazione simultanea di doppi marcatori genetici

La reazione a catena della polimerasi digitale duplex (ddPCR) consente il rilevamento quantitativo simultaneo di due marcatori genetici distinti.

Per iniziare, prelevare un campione contenente due diverse sequenze target. Aggiungere una miscela contenente un enzima DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer specifici per il bersaglio. Successivamente, aggiungere due diverse sonde oligonucleotidiche specifiche per il bersaglio, etichettate con reporter fluorescenti e una molecola di quencher per rilevare bersagli amplificati.

La soluzione viene emulsionata con olio per suddividere le sequenze bersaglio in numerose nanogoccioline. Ogni gocciolina contenente il bersaglio agisce come un singolo recipiente di reazione.

Avviare il processo di ciclo termico per la reazione di amplificazione all'interno delle singole nanogoccioline.

Ad un'elevata temperatura di denaturazione, i bersagli a doppio filamento si separano in singoli filamenti.

Abbassare la temperatura per raggiungere la temperatura di ricottura appropriata, consentendo ai primer e alle sonde oligonucleotidiche di legarsi al modello.

La vicinanza del quencher sopprime la fluorescenza del reporter. Alla temperatura di estensione, la DNA polimerasi estende i primer e slega la sonda oligonucleotidica. Il reporter non vincolato emette fluorescenza.

Far passare le goccioline attraverso un lettore di gocce, un sistema di rilevamento della fluorescenza. Il rilevamento di fluorescenza singola o doppia indica goccioline positive contenenti bersagli, mentre l'assenza di un segnale indica goccioline negative.

Il rapporto tra le goccioline positive e il numero totale di partizioni determina la concentrazione iniziale delle sequenze target.

Per iniziare questa procedura, in primo luogo, preparare concentrazioni di 100 micromoli per litro per tutti i primer in acqua di grado molecolare e le sonde in tampone TE pH 8, come descritto nel testo del protocollo. Successivamente, preparare una miscela master mescolando quantità adeguate di miscela per PCR digitale, primer diretti e inversi, sonda fluorescente e acqua priva di nucleasi. Pipettare su e giù almeno 10 volte per mescolare, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria nella soluzione.

Poiché la master mix dPCR è più viscosa della master mix qPCR convenzionale, è necessario utilizzare la tecnica della miscelazione mediante pipettaggio per creare una soluzione omogenea. Ciò consente un'accurata quantificazione della dPCR a valle.

Per preparare la miscela di analisi per la generazione di goccioline per campioni in esecuzione in duplicato, pipettare 36 microlitri della miscela master in una normale piastra PCR. A ciascuna delle miscele master da 36 microlitri, miscelare 12 microlitri di DNA stampo, lasciando vuoti i pozzetti di replica corrispondenti sulla piastra. Includere controlli positivi per garantire che il test funzioni correttamente. Non includere controlli di modelli o NTC per garantire che non vi siano contaminazioni all'interno della lastra e per impostare la linea di base fluorescente in un secondo momento per l'analisi dei dati.

Prima di configurare il generatore di gocce, miscelare le miscele di analisi utilizzando una pipetta multicanale per pipettare le miscele su e giù per circa 15 volte. Assicurarsi che il puntale della pipetta rimanga all'interno del liquido per evitare di formare bolle in eccesso all'interno della miscela.

Quindi, inserire la cartuccia uno, contenente otto pozzetti, in un portacartuccia bianco e chiudere il supporto della cartuccia. La cartuccia uno è ora saldamente in posizione e non può essere rimossa dal supporto durante la generazione di goccioline.

Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire delicatamente 20 microlitri della miscela di analisi nella posizione centrale della cartuccia contrassegnata con "Campione" senza introdurre bolle d'aria. Pipettare 70 microlitri di olio per la generazione di goccioline sul lato sinistro della cartuccia con la dicitura "Olio".

Coprire la cartuccia con una guarnizione, assicurandosi che la guarnizione sia piatta e tenuta uniformemente dai quattro segni di spunta verso il bordo della cartuccia. Premere il pulsante verde sul generatore di gocce per aprire lo sportello e posizionare la cartuccia. Premere nuovamente il pulsante per chiudere il generatore. Una volta che la porta si chiude, il pulsante verde è disattivato e la porta non può essere riaperta.

La generazione di goccioline inizierà immediatamente e continuerà per circa 1 minuto.

Mentre è in corso la generazione delle gocce, posizionare la cartuccia due in un secondo supporto bianco e prepararla nello stesso modo della cartuccia uno. Al termine della generazione delle gocce, il pulsante scarsamente illuminato diventa verde.

Aprire lo sportello del generatore di gocce. Rimuovere il supporto della cartuccia bianco contenente la cartuccia uno e metterlo da parte. Posizionare la cartuccia due nel generatore di gocce.

Rimuovere la guarnizione dalla cartuccia uno e gettarla. Non sganciare il supporto della cartuccia bianco, poiché l'azione potrebbe rompere le goccioline appena generate.

Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 40 microlitri, inserire i puntali nella terza colonna della cartuccia contrassegnati con goccioline con un angolo di 45 gradi e pipettare lentamente tutte le goccioline. Trasferirli nella piastra PCR finale posizionando il puntale della pipetta contro la parete del pozzetto a circa metà ed espellendo lentamente la gocciolina.

Allo stesso modo, quando la generazione delle goccioline per la cartuccia due è completa, rimuovere la guarnizione dalla cartuccia due e trasferire le goccioline generate sulla piastra PCR finale. Posizionare un coperchio di alluminio perforabile sopra la piastra e posizionarlo su una sigillante per piastre. Impostare il sigillante a 180 gradi Celsius. Premere "Play" sul sigillante e sigillare per 10 secondi.

Per iniziare questa procedura, posizionare la piastra PCR finale sigillata nel termociclatore. Utilizzare un termociclatore compatibile con la piastra PCR finale e con una velocità di rampa della temperatura di 2 gradi Celsius al secondo.

Eseguire il seguente programma termico: 10 minuti a 95 gradi Celsius seguiti da 40 cicli di 30 secondi a 94 gradi Celsius e 60 secondi a 60 gradi Celsius seguiti da 10 minuti di attesa a 98 gradi Celsius. Al termine del ciclo, trasferire la piastra in un lettore di gocce per la misurazione automatica della fluorescenza in ciascuna gocciolina in ciascun pozzetto.

Assicurarsi che le goccioline siano a temperatura ambiente prima di procedere con la lettura delle goccioline. Inizia aprendo il software in dotazione per impostare la lettura delle gocce. Nel menu predefinito "Configurazione" contenente uno schema di una piastra vuota da 96 pozzetti, fare doppio clic sul pozzetto A1 per aprire il menu contenente tre sezioni: "Campione", "Saggio 1" e "Saggio 2".

Nella sezione del campione, digita l'ID del campione nella casella "Nome" e seleziona la casella a destra contrassegnata con "Applica". Quindi, fai clic sul menu a discesa con l'etichetta "Esperimento". Scegli "ROSSO" per il rilevamento di eventi rari e fai clic su "Invio".

Passare alla sezione indicata come "A1". Nella sezione "Nome", compila il test e fai clic su "Invio". Nella casella sottostante denominata "Tipo", fai clic sul menu a discesa, scegli "Canale 1 sconosciuto" e fai clic su "Invio".

Passare alla sezione indicata come "A2". Nella sezione "Nome", compila il test e fai clic su "Invio". Nella casella sottostante denominata "Tipo", fai clic sul menu a discesa, scegli "Canale 2 sconosciuto" e fai clic su "Invio".

Tutte le informazioni dei passaggi precedenti sono ora presenti nel pozzetto A1.

Assegnare un nome a tutti i pozzetti successivi contenenti goccioline. Per risparmiare il tempo totale di configurazione, fare clic su "Sposta" o "Controllo" per scegliere più pozzetti contemporaneamente. Quando la rappresentazione digitale della targa rispecchia la targa fisica, premere "OK" in basso a destra del menu. Nel nuovo menu che appare nella parte superiore dello schema della targa, nella sezione "Modello", scegli "Salva con nome" e assegna un nome e salva la targa.

A sinistra dello schermo, fai clic su "Esegui" e seleziona il set di coloranti appropriato nella finestra a comparsa "Opzioni di esecuzione". La raccolta dei dati verrà avviata e visualizzata in tempo reale nel software.