PCR quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale per la diagnosi di infezioni virali

PCR quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale è utile per identificare le infezioni virali.

Inizia con un campione contenente l'RNA virale bersaglio. Aggiungere primer specifici per il bersaglio, che aiutano sia nella sintesi che nell'amplificazione del DNA, insieme all'enzima trascrittasi inversa e ai dNTP.

Aggiungi la DNA polimerasi termostabile, un enzima per amplificare il DNA attraverso i cicli di PCR, e il verde SYBR, un colorante che si intercala in DNA a doppio filamento, dsDNA. Posizionare la reazione in un termociclatore. Impostare una temperatura appropriata affinché i primer si leghino all'RNA bersaglio.

La trascrittasi inversa aggiunge dNTP al primer e contemporaneamente scinde l'RNA stampo, sintetizzando il cDNA.

Aumentare la temperatura, inattivando la trascrittasi inversa. Abbassare la temperatura, consentendo ai primer di ricuocere il cDNA per la successiva amplificazione. Aumentare la temperatura per raggiungere la fase di estensione, dove la DNA polimerasi estende i primer, sintetizzando il dsDNA.

Cicli consecutivi provocano un'amplificazione esponenziale del dsDNA. Il verde SYBR si lega al DNA in numero crescente, causando un aumento proporzionale dell'emissione di fluorescenza. Traccia il segnale di fluorescenza rilevato durante i cicli.

Una curva di amplificazione positiva indica la presenza di RNA virale nel campione.

Aumentare la temperatura in modo incrementale per raggiungere la temperatura di fusione, denaturando il dsDNA in singoli filamenti. Le molecole di colorante legate vengono rilasciate, perdendo la loro fluorescenza. Traccia la fluorescenza decrescente rispetto alla temperatura.

Un picco corrispondente alla temperatura di fusione specifica del virus conferma l'infezione virale.

Pianifica il layout della tua piastra PCR con un foglio di calcolo, tenendo conto sia dei campioni di prova che di controllo. Preparare una workstation PCR disinfettando le superfici e, se si utilizza una cabina UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'inizio.

Rimuovere i reagenti e i primer dal congelatore per scongelarli, ma mantenere sempre la miscela di enzimi sul ghiaccio. Mescolare i reagenti e centrifugare brevemente per raccogliere il liquido. Preparare le miscele master PCR per lyssavirus e beta-actina, secondo le indicazioni del manoscritto. Lasciare i master-mix in ghiaccio fino al momento dell'uso. Miscelare e centrifugare le master-miscele preparate ed erogare 19 microlitri nei relativi pozzetti della piastra o della striscia di provette compatibile con la macchina PCR.

In una stanza separata o in un armadio UV, aggiungere con cura 1 microlitro dell'RNA preparato. Se si utilizza un armadio UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'avvio. Dopo i campioni di test, aggiungere il controllo positivo e il controllo nessun modello.

Quando si aggiunge l'RNA alle miscele master, assicurarsi che sia stato aggiunto al pozzetto corretto. Usa il piano della piastra per aiutare questo passaggio.

Sigillare la piastra, controllando che i coperchi siano piatti sulla piastra, e ruotarla verso il basso per raccogliere tutto il liquido sul fondo dei pozzetti. Assicurati che ogni pozzetto abbia lo stesso volume di liquido e che non siano visibili bolle. Quindi, trasferire i campioni sulla macchina per PCR.

Apri il programma, scegliendo 'SYBR Green' con 'Dissociazione'. Selezionare i pozzetti da analizzare, scegliendo "Sconosciuto" come tipo di campione e "SYBR" come colorante fluorescente. Etichettare i pozzetti sul layout della piastra con le informazioni sul campione, incluso se il test è per il pozzetto di Lyssavirus o per la beta-actina.

Fare clic su "Impostazione profilo termico " e modificare le condizioni dei cicli termici come specificato nel manoscritto. Fai clic su "Avvia", quindi scegli una posizione in cui salvare il file e seleziona la casella per spegnere la lampada al termine della corsa. Quando viene visualizzata l'opzione per avviare prima del riscaldamento della lampada, fare clic su "Esegui ora", ma assicurarsi che la lampada abbia meno di 15 minuti per riscaldarsi.