JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:08 min. • July 8th, 2025
PCR quantitativa a trascrizione inversa in tempo reale è utile per identificare le infezioni virali.
Inizia con un campione contenente l'RNA virale bersaglio. Aggiungere primer specifici per il bersaglio, che aiutano sia nella sintesi che nell'amplificazione del DNA, insieme all'enzima trascrittasi inversa e ai dNTP.
Aggiungi la DNA polimerasi termostabile, un enzima per amplificare il DNA attraverso i cicli di PCR, e il verde SYBR, un colorante che si intercala in DNA a doppio filamento, dsDNA. Posizionare la reazione in un termociclatore. Impostare una temperatura appropriata affinché i primer si leghino all'RNA bersaglio.
La trascrittasi inversa aggiunge dNTP al primer e contemporaneamente scinde l'RNA stampo, sintetizzando il cDNA.
Aumentare la temperatura, inattivando la trascrittasi inversa. Abbassare la temperatura, consentendo ai primer di ricuocere il cDNA per la successiva amplificazione. Aumentare la temperatura per raggiungere la fase di estensione, dove la DNA polimerasi estende i primer, sintetizzando il dsDNA.
Cicli consecutivi provocano un'amplificazione esponenziale del dsDNA. Il verde SYBR si lega al DNA in numero crescente, causando un aumento proporzionale de
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