PCR bloccante wild-type per rilevare mutazioni somatiche a bassa frequenza
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:11 min. • July 8th, 2025
La reazione a catena della polimerasi bloccante wild-type, o WTB-PCR, rileva mutazioni puntiformi amplificando selettivamente gli alleli mutanti a bassa abbondanza e inibendo l'amplificazione degli alleli wild-type ad alta abbondanza nei campioni di DNA.
La WTB-PCR utilizza acidi nucleici bloccati, o oligonucleotidi modificati a filamento singolo contenenti LNA, complementari al filamento di DNA wild-type del campione che si lega specificamente al filamento complementare. Il legame con l'LNA blocca l'attività della DNA polimerasi e inibisce l'allungamento del DNA stampo wild-type.
Per eseguire la WTB-PCR, prelevare una miscela master contenente dNTP, LNA e primer diretti e inversi specifici per il bersaglio in acqua distillata priva di nucleasi.
Aggiungere una soluzione termostabile contenente DNA polimerasi alla provetta e pipettare la miscela nel pozzetto di una piastra PCR. Aggiungere il campione di DNA genomico contenente DNA wild-type e mutante nel pozzetto e iniziare la PCR.
Durante la PCR, la denaturazione mediata da alta temperatura separa i DNA a doppio filamento. I filamenti separati fungono da modelli per la ricottura dei primer, mentre l'LNA si lega al suo filamento com
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