JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:02 min. • July 8th, 2025
La microsfera-PCR utilizza una sfera di dimensioni microscopiche accoppiata a oligonucleotidi sulla loro superficie, che consente l'amplificazione preferenziale del DNA a singolo filamento.
Per iniziare la microsfera-PCR, prelevare una miscela di reazione contenente filamenti di DNA a filamento singolo stampo, primer in avanti con un tag nucleotidico aggiuntivo, DNA polimerasi termostabile, dNTP e microsfere che mostrano sonde oligonucleotidiche a singolo filamento.
Posizionare il tubo in un termociclatore e farlo funzionare alle condizioni definite.
Nel primo ciclo, alla temperatura di ricottura, il DNA stampo si lega alla sonda sulla superficie della microsfera in modo tale che il DNA stampo funzioni come filamento di senso. Durante l'estensione, la polimerasi estende il DNA e il duplex rimane attaccato alla microsfera.
Nel ciclo successivo, durante la denaturazione, il DNA stampo si separa dalla microsfera, lasciando il filamento della sonda legato alla superficie, fungendo da modello per un nuovo filamento.
Durante la ricottura, il primer marcato si lega al filamento antisenso. Successivamente, la polimerasi lo estende per sintetizzare il filamento sensoriale con il tag nucleotidico.
Ripetere il ciclo più volte per generare più copie di DNA a singolo filamento senso, che entrano nella soluzione, mentre i contaminanti a doppio filamento rimangono attaccati.
Trasferire i prodotti PCR in una provetta contenente un tampone di caricamento. Caricare il prodotto e i marcatori in diversi pozzetti del gel e separare utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
I DNA stampo formano una debole banda a basso peso molecolare, mentre un'intensa banda ad alto peso molecolare conferma l'amplificazione del DNA a singolo filamento.
Ottenere circa 25 microsfere attraverso il conteggio microscopico utilizzando un microscopio ottico con ingrandimento 40X. Successivamente, combinare tutti i reagenti come descritto nel protocollo di testo. Posizionare i campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle condizioni appropriate.
La raccolta del surnatante dopo una PCR simmetrica è uno dei passaggi più critici perché è un processo importante per la generazione di DNA a filamento singolo con microsfere.
Dopo l'amplificazione, aggiungere otto microlitri di tampone di caricamento 6X a ciascun campione. Caricare 15 microlitri di ciascun campione in gel di agarosio al 2%. Quindi, eseguire l'elettroforesi a 100 volt per 35 minuti in tampone 1X TAE.