JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:09 min. • July 8th, 2025
reazione a catena della polimerasi di fusione ad alta risoluzione, HRM-PCR, rileva le variazioni di sequenza del DNA a doppio filamento e del dsDNA con elevata precisione.
Inizia con una miscela master contenente Taq polimerasi inattiva, desossiribonucleotide trifosfati - dNTP - e il colorante reporter fluorescente. Aggiungere gli inneschi avanti e indietro. Pipettare la miscela nei pozzetti di una piastra PCR.
Aggiungi il modello dsDNA. Sigillare la piastra, impedendo l'evaporazione della miscela. Inizia la PCR.
L'elevata temperatura di denaturazione denatura il dsDNA in DNA a filamento singolo, ssDNA, e attiva la polimerasi. La reazione viene quindi raffreddata alla temperatura di ricottura, facilitando il legame diretto e inverso del primer agli ssDNA tramite l'appaiamento di basi complementari sito-specifiche.
La polimerasi attivata viene reclutata, estendendo il duplex DNA-primer mediante l'aggiunta di dNTP.
Il colorante reporter fluorescente, un colorante specifico per il dsDNA presente in concentrazioni saturanti, si intercala all'interno dell'intero duplex, fluorescente. Il duplex viene sottoposto a più cicli di PCR, producendo diversi frammenti contenenti varianti.
Dopo
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