Reazione a catena della polimerasi Multiplex Droplet per rilevare la metilazione del DNA nei leucociti

La metilazione del residuo di citosina nel DNA è una caratteristica dei leucociti o dei globuli bianchi.

La reazione a catena della polimerasi a goccioline multiplex, o mdPCR, consente l'identificazione simultanea di più regioni di DNA metilato all'interno dei leucociti.

Preparare una miscela contenente tampone di reazione, DNA polimerasi e acqua priva di nucleasi. Aggiungere primer diretti e inversi e sonde di idrolisi fluorescenti specifiche per ogni regione target. Le sonde sono costituite da reporter fluorofori di colore diverso legati a quencher per inibire l'emissione di fluorescenza.

Aggiungere il DNA convertito con bisolfito, in cui le citosine non metilate vengono deaminate in uracili mentre le citosine metilate rimangono invariate. Mescolare.

Riempire una siringa di vetro con una miscela di olio vettore-tensioattivo e un'altra con una miscela di olio vettore-PCR e collegarle al generatore di goccioline microfluidiche. La miscela PCR acquosa con olio vettore si emulsiona in goccioline di dimensioni inferiori al nanolitro. Il tensioattivo stabilizza l'emulsione e previene la fusione delle goccioline.

Raccogli le goccioline ed esegui la PCR. All'interno di ogni gocciolina, l'elevata temperatura di denaturazione denatura il DNA a doppio filamento in DNA a singolo filamento e attiva la polimerasi. La temperatura di reazione viene abbassata, consentendo la ricottura sito-specifica dei primer e delle sonde.

Quando la polimerasi si lega ed estende il duplex DNA-primer, gli uracili si amplificano come timine, mentre le citosine metilate si amplificano come citosine, consentendo la distinzione delle regioni metilate e non metilate. La polimerasi inoltre sfaglia e rilascia il reporter dalla sonda, causando l'emissione di fluorescenza.

Dopo la PCR, visualizzare le gocce al microscopio. Il colore della fluorescenza indica la presenza di specifici bersagli di DNA metilato.

Per la generazione di goccioline, mescolare 1 microlitro di DNA convertito con bisolfito con la miscela master della sonda appena preparata in una provetta PCR e raccogliere il campione con una breve centrifugazione. Utilizzare raccordi in PEEK per collegare il tubo fluidico monouso a due siringhe di vetro di precisione da 250 microlitri di volume e pre-riempire una siringa di vetro di precisione con 250 microlitri di olio vettore contenente il 5% di fluoro-tensioattivo e una siringa di vetro di precisione con 50 microlitri di olio vettore.

Quando entrambe le siringhe sono state caricate, caricare 100 microlitri della miscela PCR nella siringa di olio vettore e posizionare un dispositivo microfluidico a goccioline sul tavolino di un microscopio ottico verticale dotato di una telecamera ad alta velocità.

Per l'osservazione e la registrazione della formazione di goccioline in tempo reale, posizionare le siringhe preriempite su una pompa a siringa programmabile e utilizzare il raccordo in PEEK con raccordi per collegare il tubo delle siringhe al tubo dei rispettivi canali di ingresso del dispositivo microfluidico a goccioline.

Posizionare il tubo dall'uscita del generatore di gocce all'interno di una provetta PCR da 0,5 millilitri e regolare la portata della pompa a siringa a 2 microlitri al minuto. Lasciare che la dimensione delle gocce si stabilizzi prima di raccogliere l'emulsione risultante. Raccogliere lentamente e con attenzione l'emulsione dalla parte superiore della provetta e trasferire 75 microlitri di soluzione in una provetta PCR da 200 microlitri per il ciclo termico.

Quindi, verificare che il contenuto di olio nella provetta PCR corrisponda strettamente al volume della fase dispersa per evitare la coalescenza delle goccioline durante il ciclo termico e posizionare la provetta da 200 microlitri nel termociclatore.