PCR digitale basata su chip-in-a-tube per la quantificazione di varianti a singolo nucleotide

reazione a catena della polimerasi digitale, o dPCR, è utile per quantificare le varianti a singolo nucleotide, o SNV, una mutazione in cui la sostituzione di un singolo nucleotide in una posizione specifica nel genoma crea due variazioni nucleotidiche o alleli.

Per iniziare la quantificazione utilizzando la tecnica dPCR chip-in-a-tube, prelevare un campione di DNA contenente SNV, l'allele mutante e il corrispondente allele wild-type. Aggiungere una miscela contenente un enzima DNA polimerasi termostabile, dNTP e primer.

Successivamente, aggiungi sonde oligonucleotidiche specifiche per l'allele, etichettate con reporter di fluorescenza di colore diverso per distinguere tra gli alleli, e una molecola di quencher. La vicinanza del quencher al reporter ne sopprime la fluorescenza.

Dividere la soluzione nelle camere di reazione di un chip microfluidico. Ogni camera contenente un allele funge da recipiente di reazione indipendente.

Posizionare il tubo con il chip all'interno di un termociclatore e avviare la reazione. Ad alta temperatura, il DNA a doppio filamento si denatura in singoli filamenti. Abbassare la temperatura per ricuocere i primer e le sonde oligonucleotidiche nelle loro regioni complementari.

A una temperatura di estensione appropriata, la DNA polimerasi estende i primer e fende la sonda. La distanza dal quencher consente l'emissione di fluorescenza del reporter.

Leggi i segnali di fluorescenza di diversi colori e crea un grafico di posizione per rilevare le camere contenenti gli alleli.

Per determinare la frequenza dell'allele mutante - la frazione allelica variante - calcola il rapporto tra le camere contenenti l'allele mutante rispetto all'allele wild-type.

Aggiungi primer, sonde e DNA genomico progettati in precedenza a una nuova striscia di 8 provette, per ottenere un volume totale di 15 microlitri. Pipettare su e giù per mescolare.

Aggiungere la piattaforma di carico sui trucioli incorporati nella nuova striscia a 8 tubi, quindi posizionare la striscia di tubi nel caricatore automatico. Assicurarsi che ci sia un contatto tra i trucioli e la piattaforma di carico. Quindi, posizionare il cursore di caricamento nella piattaforma e utilizzare un tappo per tenere il cursore fuori dal caricatore. Pipettare 15 microlitri della miscela PCR vicino alla punta del cursore, quindi premere il pulsante del caricatore per far funzionare il caricatore per 1 minuto.

Rimuovere la striscia di tubo dal caricatore dopo la corsa e posizionarla nel potenziatore di tenuta. Spingere con cautela il coperchio scorrevole e il bordo del coperchio superiore. Far funzionare il potenziatore di tenuta per circa 2 minuti. Se la sigillatura è incompleta, indicata da una pozza di liquido, ripetere la corsa per un altro minuto.

Aggiungere 230 microlitri di liquido sigillante ai tubi. Posizionare la striscia di provette nel termociclatore ed eseguire la PCR come descritto nel protocollo. Se c'è una distribuzione non uniforme delle partizioni positive, regolare la temperatura o la durata della PCR.

Per rilevare e analizzare l'intensità della fluorescenza dei prodotti PCR, posizionare la striscia della provetta sulla maschera di rilevamento e aggiungere 6 millilitri di acqua distillata. Rimuovere eventuali bolle d'aria visibili utilizzando un puntale per pipetta.

Caricare la maschera nel rilevatore. Nel software di rilevamento, selezionare le schede "Fluorescenza", "Esperimento", quindi "Campione/NTC" e fare clic sul pulsante "Esegui" per avviare la corsa. Al termine dell'esecuzione, confermare il grafico della posizione, l'istogramma e il grafico a dispersione 2D.

Per raccogliere il prodotto PCR, rimuovere il liquido sigillante dalla provetta. Aggiungere 100 microlitri di tampone TE e agitare energicamente per 30 secondi. Centrifugare brevemente le provette in una centrifuga da tavolo e procedere come descritto nel protocollo di testo, per terminare la raccolta del prodotto PCR.