Dot blot quantitativo per stimare le proteine bersaglio in un lisato tissutale

Il dot blot quantitativo, o QDB, è una tecnica utile per quantificare la concentrazione di proteine bersaglio in un campione. Una volta che il campione è immobilizzato su una membrana polimerica, le proteine possono essere rilevate tramite immunoblotting.

Per iniziare, prendi una piastra QDB, una piastra multipozzetto con una membrana di nitrocellulosa attaccata al fondo di ciascun pozzetto. Aggiungere il campione, un lisato tissutale contenente la proteina bersaglio, al centro della membrana all'interno del pozzetto.

Lasciare asciugare il campione. La proteina bersaglio si lega alla membrana tramite interazioni non covalenti.

Aggiungere una soluzione di blocco. Le proteine nella soluzione si attaccano ai siti non legati sulla membrana, impedendo il legame non specifico dei reagenti di rilevamento.

Quindi, aggiungere una soluzione contenente anticorpi primari che si legano alla proteina bersaglio nel campione. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Quindi, aggiungere una soluzione di anticorpi secondari. Queste molecole, marcate con un enzima perossidasi, si legano agli anticorpi primari legati alle proteine. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Infine, aggiungere una soluzione contenente un substrato chemiluminescente e perossido di idrogeno. Utilizzando il perossido di idrogeno, la perossidasi legata all'anticorpo ossida il substrato ed emette luce. Utilizzando un lettore di piastre, misurare l'intensità di luminescenza del campione.

Generare una curva di luminescenza standard utilizzando una diluizione seriale con concentrazioni note della proteina bersaglio. Tracciare il valore di luminescenza misurato del campione sulla curva per determinare la concentrazione proteica target.

In questa procedura, posizionare una scatola vuota dei puntali della pipetta sotto la piastra QDB per evitare che la parte inferiore della piastra tocchi la superficie del tavolo. Caricare fino a 2 microlitri di campione al centro della membrana nella parte inferiore di una singola unità della piastra QDB.

Non lasciare mai che la parte inferiore della piastra QDB tocchi alcuna superficie, durante il caricamento, e non caricare troppo per il singolo pozzetto. Non si verificano più di 4 microlitri per pozzetto.

Quindi, lasciare la piastra QDB caricata per un'ora a temperatura ambiente o lasciare la piastra caricata a 37 gradi Celsius per quindici minuti in uno spazio ben ventilato. Per bloccare la piastra, immergere la piastra QDB nel tampone di trasferimento e agitarla delicatamente per 10 secondi.

Successivamente, sciacquare delicatamente la piastra QDB con TBST tre volte e quindi lavare la piastra per cinque minuti in TBST agitando costantemente. Successivamente, bloccare la piastra QDB con tampone di blocco per un'ora sotto agitazione costante. A questo punto, diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante a una concentrazione prescelta e aggiungerne 100 microlitri a ogni singolo pozzetto di una normale piastra a 96 pozzetti.

Inserire la piastra QDB nella piastra a 96 pozzetti e incubare le piastre combinate per due ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 gradi Celsius sotto agitazione costante. Dopodiché, sciacquare delicatamente la piastra con TBST tre volte, prima di lavarla con TBST tre volte, ogni volta per cinque minuti sotto agitazione costante.

Quindi, diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante alla concentrazione scelta e aliquotare 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Quindi, incubare la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti caricata per un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione costante. Sciacquare delicatamente la piastra QDB tre volte con TBST, quindi lavare la piastra tre volte, cinque minuti ciascuna con TBST agitando costantemente.

Per la quantificazione, preparare il substrato ECL e aliquotare in una piastra a 96 pozzetti a 100 microlitri per pozzetto. Quindi, inserire la piastra QDB all'interno della piastra a 96 pozzetti per due minuti agitando costantemente. Successivamente, rimuovere la piastra QDB dalla piastra a 96 pozzetti e agitare brevemente per rimuovere il liquido in eccesso. Successivamente, posizionare la piastra su una piastra per microtitolazione bianca. Quindi, accendere il lettore di micropiastre e selezionare la piastra con coperchio sull'interfaccia utente, prima di posizionare le piastre combinate all'interno del lettore di micropiastre per la quantificazione.