Western blotting quantitativo per stimare i livelli di espressione proteica

Il western blotting quantitativo, una tecnica basata sulla normalizzazione totale delle proteine, è utile per quantificare i livelli di espressione della proteina bersaglio.

Per iniziare, caricare il lisato tissutale nei pozzetti di un gel a gradiente di poliacrilammide. Il lisato contiene la proteina bersaglio, insieme ad altre proteine cellulari.

Far funzionare il gel a una tensione appropriata per la separazione elettroforetica delle proteine del campione lungo il gradiente. Al termine, posizionare il gel sopra la membrana polimerica di una pila di trasferimento.

Applicare una corrente elettrica per trasferire le proteine separate sulla membrana. Quindi, posizionare la membrana in una colorazione fluorescente di proteine totali. Le molecole di colorante cariche nella macchia si legano elettrostaticamente a tutte le proteine sulla membrana.

Aggiungere una soluzione di blocco. Le proteine nella soluzione si legano alla membrana, quindi. impedendo il legame non specifico dei reagenti di rilevamento. Aggiungere un anticorpo primario che si lega solo alla proteina bersaglio. Quindi, aggiungi un anticorpo secondario, marcato con un fluoroforo, che si attacca all'anticorpo primario.

Eccitare il campione con un laser. Registrare la fluorescenza emessa dalle molecole di colorante della colorazione proteica totale e dai fluorofori legati agli anticorpi alle lunghezze d'onda corrispondenti.

Per calcolare il valore di carico proteico normalizzato, dividere il segnale proteico totale di ciascuna corsia per il valore più alto. Dividi il segnale della proteina bersaglio per il corrispondente valore di carico normalizzato per determinare l'espressione relativa della proteina bersaglio.

Per l'elettroforesi, impostare un gel a gradiente di Bis-Tris prefabbricato dal 4 al 12% nel sistema della camera di elettroforesi su gel e caricare 3,5 microlitri di uno standard proteico nel pozzetto. Quando si utilizza uno standard interno per la normalizzazione tra le membrane, caricare una quantità uguale agli altri campioni nei primi tre pozzetti accanto alla scala delle proteine e caricare 30 microgrammi di ciascun campione nei pozzetti rimanenti. Quindi, far passare i campioni attraverso il gel di impilamento a 80 volt per 10 minuti, seguiti da 150 volt per altri 45-60 minuti.

Al termine dell'elettroforesi, per assemblare la pila di trasferimento, posizionare il gel proteico sulla pila inferiore contenente la membrana di difluoruro di polivinilidene seguita dalla carta da filtro. Utilizzare il rullo assorbente per rimuovere eventuali bolle d'aria e posizionare la pila superiore sulla parte superiore della carta da filtro, prima di arrotolare nuovamente la pila per rimuovere le bolle d'aria.

Trasferire l'intera pila nel dispositivo di trasferimento con l'elettrodo sul lato sinistro del dispositivo e posizionare la spugna in gel sopra la pila, in modo che la spugna sia allineata con i corrispondenti contatti elettrici sul dispositivo.

Dopo aver chiuso il coperchio, selezionare e avviare il programma appropriato. Al termine del programma, tagliare la membrana alla dimensione del gel e lavare rapidamente la membrana tagliata con acqua distillata doppia prima di continuare con la colorazione proteica totale.

Per la colorazione totale delle proteine, arrotolare la membrana in una provetta da 50 millilitri con il lato proteico rivolto verso l'interno ed etichettare la membrana con 5 millilitri di soluzione di colorante proteico su un rullo per 5 minuti a temperatura ambiente in una cappa aspirante.

Al termine dell'incubazione, lavare rapidamente la membrana con 5 millilitri di soluzione di lavaggio, rimettendo brevemente la provetta sul rullo tra un lavaggio e l'altro, seguita da un breve risciacquo con acqua ultrapura. Aggiungere 3 millimetri di tampone bloccante alla membrana e rimettere la membrana nel rullo per 30 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone bloccante con l'anticorpo primario di interesse alla concentrazione ottimizzata appropriata e incubare la membrana sul rullo per una notte a 4 gradi Celsius.

Il giorno successivo, lavare la membrana 6 volte per 5 minuti con 5 millilitri di PBS fresco per lavaggio sul rullo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la membrana con l'appropriata soluzione di anticorpi secondari sul rullo per 1 ora a temperatura ambiente seguita da 3 lavaggi per 30 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare la membrana e utilizzare un foglio di alluminio per proteggere la membrana dalla luce.

Per l'acquisizione delle immagini, posizionare la membrana sullo scanner con il lato proteico rivolto verso il basso e selezionare l'area di scansione nel software. Quindi acquisisci le immagini in entrambi i canali ed esporta le immagini in un programma di analisi delle immagini appropriato.

Visualizza il canale a 700 nanometri per mostrare il risultato totale della colorazione delle proteine, quindi seleziona "Analisi" e disegna un rettangolo per definire l'area di interesse per la normalizzazione. Quindi, copia e incolla la prima area del rettangolo su ogni singolo campione per assicurarti che la regione definita abbia le stesse dimensioni per tutte le corsie analizzate.

Per quantificare la concentrazione proteica in ciascuna corsia, copiare i risultati sia dalla colorazione proteica totale che dalla proteina di interesse in un programma di foglio di calcolo e determinare il segnale di colorazione proteica totale più alto. Quindi dividere ciascun valore totale del segnale della colorazione proteica per questo valore per ottenere il valore di carico proteico normalizzato e dividere il valore del segnale a 800 nanometri da ogni singolo campione per il corrispondente valore proteico normalizzato per calcolare il rapporto di espressione proteica relativa in diversi campioni.