Northern Blot per rilevare e quantificare microRNA specifici nell'estratto di RNA totale di tessuto vegetale

I microRNA, miRNA, sono piccoli RNA non codificanti a singolo filamento. I miRNA si incorporano in un complesso multiproteico e si legano ulteriormente a sequenze di mRNA bersaglio complementari per regolare negativamente l'espressione genica.

Per rilevare miRNA specifici dall'RNA totale dei tessuti vegetali, aggiungere un colorante carica-gel contenente coloranti traccianti e formammide, un agente denaturante dell'RNA. Riscaldare il campione per denaturare l'RNA e prevenire la formazione di strutture secondarie prima dell'elettroforesi.

Caricare il campione e i marcatori di RNA standard nei pozzetti di un gel di poliacrilammide denaturante preassemblato. Eseguire l'elettroforesi, facilitando la separazione dei frammenti di RNA in base alle dimensioni.

Trasferire il gel su carta da filtro pre-bagnata su una cassetta per elettroblotting. Allineare una membrana assorbente di nylon imbevuta di tampone sul gel. Quindi, impilare le carte da filtro pre-bagnate. Eseguire l'elettroblotting.

La corrente elettrica fa sì che l'RNA caricato negativamente, incluso il miRNA, si sposti fuori dal gel sulla superficie della membrana di nylon caricata positivamente. Esporre la membrana alla luce ult