Northern Blot per rilevare e quantificare microRNA specifici nell'estratto di RNA totale di tessuto vegetale

I microRNA, miRNA, sono piccoli RNA non codificanti a singolo filamento. I miRNA si incorporano in un complesso multiproteico e si legano ulteriormente a sequenze di mRNA bersaglio complementari per regolare negativamente l'espressione genica.

Per rilevare miRNA specifici dall'RNA totale dei tessuti vegetali, aggiungere un colorante carica-gel contenente coloranti traccianti e formammide, un agente denaturante dell'RNA. Riscaldare il campione per denaturare l'RNA e prevenire la formazione di strutture secondarie prima dell'elettroforesi.

Caricare il campione e i marcatori di RNA standard nei pozzetti di un gel di poliacrilammide denaturante preassemblato. Eseguire l'elettroforesi, facilitando la separazione dei frammenti di RNA in base alle dimensioni.

Trasferire il gel su carta da filtro pre-bagnata su una cassetta per elettroblotting. Allineare una membrana assorbente di nylon imbevuta di tampone sul gel. Quindi, impilare le carte da filtro pre-bagnate. Eseguire l'elettroblotting.

La corrente elettrica fa sì che l'RNA caricato negativamente, incluso il miRNA, si sposti fuori dal gel sulla superficie della membrana di nylon caricata positivamente. Esporre la membrana alla luce ultravioletta; questo lega gli RNA alla membrana, prevenendo così la perdita di RNA.

Incubare la membrana in un tampone di ibridazione contenente agenti bloccanti che occupano i siti di legame non specifici per ridurre il rumore di fondo.

Aggiungere una sonda oligonucleotidica RNA radiomarcata complementare al miRNA bersaglio per legarsi specificamente ad esso. Lavare la membrana con il tampone, rimuovendo le sonde non legate.

Utilizzare un sistema di imaging al fosforo per rilevare e quantificare l'intensità del segnale di ibridazione radioattiva. Il segnale ad alta risoluzione indica l'espressione specifica di miRNA nel tessuto vegetale.

Interrompere la pre-corsa del gel.

Lavare accuratamente i pozzetti prima di caricare il campione per rimuovere i depositi di urea all'interno dei pozzetti. Riscaldare i campioni di RNA risospeso a 98 gradi per 1 minuto. Caricare i campioni caldi nei pozzetti utilizzando le punte capillari. Evitare l'introduzione di bolle d'aria.

Completare il caricamento di tutti i campioni e assemblare il coperchio. Far funzionare il gel a 80 volt per 3 ore, o fino a quando il blu di bromofenolo non scorre completamente. Utilizzare una membrana di nylon caricata positivamente per il trasferimento. Taglialo alle dimensioni della lastra di vetro. Etichetta la membrana nell'angolo in alto a destra. Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua sterile Milli-Q. Assicurati di posizionare l'etichetta con il lato rivolto verso il basso rivolto verso la superficie dell'acqua.

Prendi un vassoio pulito e prepara il sandwich in gel per l'elettrotrasferimento. Posizionare il lato grigio della cassetta verso il basso. Versare 1X TBE leggermente sopra il livello della cassetta. Pre-bagnare il tampone in fibra in 1X TBE e strizzarlo per rimuovere le bolle d'aria. Taglia due pezzi di carta assorbente delle dimensioni di un tampone di fibra.

Pre-bagnare un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e posizionarlo sopra il tampone di fibra. Rimuovere le bolle d'aria arrotolando una pipetta di plastica sulla carta. Pre-bagnare un altro pezzo di carta assorbente in un TBE 1X e appoggiarlo sopra la cassetta. Ribaltare per rimuovere le bolle d'aria. Ora la configurazione a sandwich è pronta per l'elettrotrasferimento.

Al termine dell'elettroforesi, interrompere la corsa e rimuovere il coperchio dall'apparecchio. Rimuovere la cassetta di funzionamento dalla configurazione. Estrarre le lastre di vetro dalla cassetta di scorrimento.

Rimuovere con cautela il gel dal gruppo. Appoggialo sulla carta assorbente in modo che il primo campione di RNA caricato sia verso la tua destra. Immergere delicatamente la membrana pre-imbevuta in 1X TBE e posizionarla sopra il gel rivolto verso il basso con l'etichetta. Non lasciare asciugare la membrana e il gel. Arrotolare delicatamente per rimuovere le bolle d'aria.

Immergi un pezzo di carta assorbente in 1X TBE e stendilo sulla membrana. Rimuovere le bolle d'aria. Metti un altro pezzo di carta assorbente e rimuovi le bolle d'aria. Completa il sandwich posando il tampone in fibra sopra l'assemblaggio. Chiudere bene la cassetta.

Posizionare la cassetta transblot nel modulo. Riempire il serbatoio con 1X TBE, pH 8,2, fino al segno di tamponamento. Chiudere il coperchio dell'apparecchio e trasferire a 10 volt durante la notte a 4 gradi o in una cella frigorifera. Tenere pronto il reticolante UV e impostarlo a 1.200 appena prima del completamento dell'elettrotrasferimento.

Al termine del trasferimento, rimuovere la cassetta dal modulo. Posizionare la membrana umida su un foglio A4 posizionando il lato segnato verso l'alto. Reticolare l'RNA alla membrana mediante irradiazione con luce UV a 254 nanometri a 120 millijoule. Il blot reticolato può essere conservato a 4 gradi o utilizzato per l'ibridazione.

Progettare una sonda che sia completamente complementare al piccolo RNA che deve essere rilevato, etichettare la sonda alla sua estremità 5 prime utilizzando l'enzima PNK e combinare i componenti come mostrato. Incubare la miscela di reazione a 37 gradi per 30 minuti.

Dopo 30 minuti di incubazione, utilizzare le colonne G-25 per separare le sonde non etichettate dalla miscela di reazione. Per una migliore etichettatura della sonda, preparare la colonna G-25 prima dell'uso. Posizionare il blot, con il lato dell'RNA rivolto verso l'alto, all'interno di un flacone di ibridazione. Mescolare energicamente il tampone di ibridazione prima dell'uso. Aggiungere 10 ml di tampone di ibridazione e posizionare la bottiglia di ibridazione all'interno di un forno di ibridazione mantenuto a 35 gradi con rotazione.

Eseguire la pre-ibridazione per 20-30 minuti. Dopo la pre-ibridazione, togliere la bottiglia dal forno. Aggiungere delicatamente la sonda etichettata nel tampone di ibridazione. Assicurarsi che non si creino bolle d'aria. Incubare la macchia all'interno del forno a 35 gradi con rotazione per 12 ore.

Dopo l'ibridazione, rimuovere il tampone di ibridazione dalla bottiglia. Eseguire un lavaggio rapido delle macchie utilizzando il tampone di lavaggio I. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso dalle macchie. Inoltre, incubare le macchie a 35 gradi per 30 minuti utilizzando il tampone di lavaggio I. Eseguire un altro lavaggio utilizzando il tampone II a 35 gradi per 30 minuti.

Dopo aver lavato via la macchia, posizionarla all'interno di una copertura di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso e sigillarla. Posizionarlo all'interno di una cassetta ed esporlo a uno schermo imager al fosforo privo di radiazioni per 12 ore. Rileva il segnale di ibridazione utilizzando il Typhoon Biomolecular Imager e analizza i risultati utilizzando il software ImageJ.