Biorilevamento a effetto di campo basato su biosensore di grafene per rilevare le interazioni proteina-proteina

Le interazioni proteina-proteina, PPI, sono fondamentali nella regolazione della maggior parte dei processi biologici.

Per rilevare i PPI utilizzando il biorilevamento a effetto di campo, iniziare con un chip transistor a effetto di campo in grafene. Il chip comprende una superficie di grafene funzionalizzata con carbossile come canale semiconduttivo tra gli elettrodi sorgente e di scarico.

Incubare il chip con una soluzione fresca di carbodiimmide e N-idrossisulfosuccinimide, sulfo-NHS, in un tampone zwitterionico. Questo tampone crea un pH adeguato, consentendo alla carbodiimmide e al sulfo-NHS di attivare i gruppi carbossilici funzionalizzati del chip, formando esteri reattivi alle ammine.

Aggiungere la soluzione proteica target. Le ammine primarie reagiscono con gli esteri reattivi all'ammina, immobilizzando le proteine sul chip attraverso la formazione di legami ammidici. Aggiungere una soluzione di tempra contenente ammina per bloccare gli esteri reattivi all'ammina non legati, prevenendo il legame non specifico.

Inserire il chip nel lettore elettronico e calibrarlo con un tampone. Il lettore applica una tensione costante tra gli elettrodi. Viene misurato il flusso di corrente elettrica risultante tra gli elettrodi nella condizione di non legato all'analita.

Aggiungere la concentrazione più bassa dell'analita. L'interazione tra le proteine dell'analita e i bersagli immobilizzati sul chip altera la distribuzione locale della carica della superficie del grafene, registrata come I-response - la variazione del flusso di corrente tra gli elettrodi.

Dopo la registrazione, lavare con un tampone per dissociare gli analiti legati. Ripetere l'analisi con concentrazioni crescenti dell'analita.

Un aumento graduale della risposta I con l'aumentare delle concentrazioni dell'analita indica forti PPI tra il bersaglio e l'analita.

Iniziare mescolando volumi uguali di soluzione EDC e sulfo-NHS pipettando su e giù. Posizionare i chip biosensori forniti dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con un coperchio montato. Si suggerisce che tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip vengano eseguite all'interno della capsula di Petri. Applicare 50 microlitri di tampone MES da 1 molare al chip del biosensore. Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.

Quindi, aspirare il tampone e applicare immediatamente 50 microlitri di soluzione EDC/sulfo-NHS sul chip del sensore. Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC/sulfo-NHS dal chip e applicare 50 microlitri di tampone MES da 1 molare.

Aspirare il tampone MES e sciacquare il chip due volte con 50 microlitri di 1x PBS. Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio Hsp90. Coprire la capsula di Petri in vetro e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare tre volte con 50 microlitri di 1x PBS.

Aspirare la soluzione 1x PBS dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione Quench 1. Coprire la capsula di Petri in vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 1 dal chip e aggiungere 50 microlitri della soluzione Quench 2. Coprire la capsula di Petri in vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare la soluzione Quench 2 dal chip e sciacquare il chip cinque volte utilizzando 50 microlitri di 1X PBS lasciando l'ultima gocciolina di PBS sul sensore.

Preparare la serie di diluizione dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato. Progettare l'esperimento in modo da includere almeno otto diverse concentrazioni di analita per ottenere una costante di dissociazione affidabile o un valore_{K d} e preparare queste diverse diluizioni nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione e la proteina target.

Posizionare con cura il chip nello strumento. Assicurati che il software sia acceso e che la luce LED diventi verde. Quindi, premere il modulo "Esegui esperimento" sul software automatizzato e scegliere "10 punti con rigenerazione" o qualsiasi altro protocollo desiderato. Inserire i dettagli, come il nome dell'operatore, il nome dell'esperimento, la data, il tampone di rigenerazione, il bersaglio immobilizzato e l'analita in soluzione. Premere il pulsante "Inizia esperimento" visualizzato sul software e seguire le istruzioni mostrate dal software automatizzato.

Per eseguire la calibrazione dello strumento, aspirare la soluzione PBS rimanente dal chip e applicare 50 microlitri di tampone di calibrazione. Premere il pulsante "Continua" e attendere cinque minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza il punto finale determinato per la fase di calibrazione con un allarme di avviso da seguire.

Successivamente, eseguire un'associazione dell'analita aspirando il tampone di calibrazione dal chip e applicando 50 microlitri della concentrazione più bassa dell'analita. Premere il pulsante "Continua" e attendere cinque minuti fino al termine della fase di associazione. Il software visualizza il punto finale per la fase di associazione con un allarme di avviso per procedere.

Per eseguire una dissociazione dell'analita, aspirare la soluzione dell'analita dal chip e applicare 50 microlitri di tampone di dissociazione. Premere il pulsante "Continua". Al termine della durata della fase di dissociazione, il software visualizza il punto finale della fase di dissociazione con un allarme di avviso.

Successivamente, eseguire la rigenerazione del truciolo aspirando la soluzione di dissociazione dal truciolo e applicando 50 microlitri di tampone di rigenerazione. Quindi, premi il pulsante "Continua". La fase di rigenerazione richiede in genere circa 30 secondi per essere completata. Successivamente, il software visualizza il punto finale per la fase di rigenerazione con l'allarme di avviso da seguire.

Infine, per lavare il truciolo, aspirare la soluzione rigenerante dal truciolo e applicare 50 microlitri di tampone di lavaggio. Aspirare la soluzione dal chip e ripetere l'operazione cinque volte. Lasciare l'ultima goccia del tampone di lavaggio sul chip. Quindi, premere il pulsante "Continua" e attendere 30 secondi fino al termine della durata della fase di lavaggio sul display del software.

Ripetere i passaggi per ogni concentrazione di analita utilizzata. Le cinque fasi della calibrazione, dell'associazione dell'analita, della dissociazione, della rigenerazione e del lavaggio cinque volte costituiscono un unico ciclo.