Saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ

Iniziare il saggio di legatura di prossimità prelevando i nematodi sezionati e fissandoli su un vetrino con le cellule germinali esposte. Queste cellule mostrano alti livelli di complessi ribonucleoproteici contenenti proteine leganti l'RNA, RBP, associati alle loro proteine partner.

Sovrapporre il vetrino con due anticorpi primari che riconoscono due proteine bersaglio specifiche: la RBP e la sua proteina partner. Integrare il vetrino con due tipi di anticorpi secondari specifici per i rispettivi anticorpi primari.

Ogni anticorpo secondario è coniugato con sonde PLA, filamenti di DNA con sequenze complementari. Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari pre-attaccati, avvicinando le due sonde PLA.

Applicare il tampone di ligazione contenente oligonucleotidi connettore – che si ibridano con le sonde PLA – e l'enzima ligasi sigilla la lacuna, generando DNA circolare. Incubare il vetrino con una soluzione di amplificazione contenente DNA polimerasi, dNTP e sonde rivelatore collegate a un fluoroforo rosso.

Utilizzando il DNA circolarizzato come modello, la polimerasi avvia un'amplificazione del cerchio rotante, generando molte copie del DNA stampo collegate tra loro. Il DNA amplificato rimane legato alla sonda PLA, consentendo la localizzazione dell'interazione proteina-proteina.

Le sonde del rivelatore, che trasportano brevi oligonucleotidi a singolo filamento, interagiscono con le regioni complementari del DNA amplificato, formando duplex e impartendo segnali di fluorescenza ai complessi proteici. Immagine del vetrino al microscopio a fluorescenza.

Osservare la presenza di macchie rosse distinte all'interno della cellula, che indicano interazioni proteina-proteina riuscite.

Utilizzare il diluente anticorpale per diluire gli anticorpi primari. Applicare 40 microlitri della soluzione di anticorpi primari diluita per uno spazio di 14 x 14 millimetri sui vetrini. Collocare i vetrini in una camera umida e incubare per una notte a 4 gradi Celsius.

Al mattino, lavare i vetrini due volte per 5 minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min. Posizionare i vetrini su un tovagliolo di carta per far scorrere il tampone di lavaggio dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi.

Preparare una soluzione da 40 microlitri contenente sonde più e meno. Aggiungi la soluzione a ogni spazio di 14 x 14 millimetri. Incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora a 37 gradi Celsius. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio A a temperatura ambiente in un barattolo Coplin.

Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min. Diluire il tampone di legatura da 1 a 5 con acqua ultrapura. Utilizzare questo tampone per diluire la ligasi da 1 a 40 per preparare una riserva di lavoro di soluzione di legatura. Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far scorrere il tampone di lavaggio dai lati e strofinare delicatamente i bordi.

Aggiungere 40 microlitri di soluzione di legatura a ciascuno spazio di 14 per 14 millimetri. Incubare i vetrini in una camera umida per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato e asciugato i vetrini come descritto in precedenza, aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione appena preparata e protetta dalla luce in ogni spazio di 14 per 14 millimetri.

Incubare i vetrini nella camera buia umida per 1 ora e 40 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare i vetrini due volte per 10 minuti ciascuno con 50 millilitri di 1x tampone di lavaggio B e lavare i vetrini una volta per 1 minuto con 50 millilitri di 0,01x tampone di lavaggio B.

Dopo aver disegnato il perimetro con rivestimento epossidico del vetrino, aggiungere 10 microlitri di terreno di montaggio a ciascun campione e stendere delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore, consentendo al mezzo di montaggio di diffondersi. Dipingi intorno al bordo del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie per sigillare il vetrino coprioggetti e il vetrino. Evitare di spostare il vetrino coprioggetti. Lasciare indurire lo smalto per almeno 20 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce.