Saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ

Iniziare il saggio di legatura di prossimità prelevando i nematodi sezionati e fissandoli su un vetrino con le cellule germinali esposte. Queste cellule mostrano alti livelli di complessi ribonucleoproteici contenenti proteine leganti l'RNA, RBP, associati alle loro proteine partner.

Sovrapporre il vetrino con due anticorpi primari che riconoscono due proteine bersaglio specifiche: la RBP e la sua proteina partner. Integrare il vetrino con due tipi di anticorpi secondari specifici per i rispettivi anticorpi primari.

Ogni anticorpo secondario è coniugato con sonde PLA, filamenti di DNA con sequenze complementari. Gli anticorpi secondari si legano agli anticorpi primari pre-attaccati, avvicinando le due sonde PLA.

Applicare il tampone di ligazione contenente oligonucleotidi connettore – che si ibridano con le sonde PLA – e l'enzima ligasi sigilla la lacuna, generando DNA circolare. Incubare il vetrino con una soluzione di amplificazione contenente DNA polimerasi, dNTP e sonde rivelatore collegate a un fluoroforo rosso.

Utilizzando il DNA circolarizzato come modello, la polimerasi avvia un'amplificazione del cerchio rotante, generando molte copie del DNA stampo collegate tra loro. Il