JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:20 min. • July 8th, 2025
Per il saggio dei due ibridi di lievito, prelevare una sospensione di cellule di lievito geneticamente modificata e a crescita attiva priva della proteina attivatrice della trascrizione, GAL4. Queste cellule non sono in grado di sintetizzare leucina e triptofano.
Aggiungere una coppia di plasmidi di espressione: uno che codifica per la leucina e il dominio legante il DNA, DNA-BD, di GAL4, fuso in un dominio proteico bersaglio, e l'altro che codifica per il triptofano e il dominio attivatore, AD, di GAL4 fusi in un altro dominio della proteina bersaglio.
Aggiungere un buffer contenente gli agenti adatti per la trasformazione. Lo shock termico delle cellule provoca la formazione transitoria dei pori, facilitando l'assorbimento del plasmide cellulare. Raffreddare per richiudere i pori. Piastra le cellule su un terreno di crescita selettivo privo di leucina e triptofano.
Le cellule trasformate che esprimono due proteine ibride sintetizzano leucina e triptofano, sopravvivono e formano colonie.
Il DNA-BD fuso in un dominio proteico si lega alla specifica sequenza di DNA a monte della regione del promotore del gene codificante la β-galattosidasi. Se i domini della proteina bersaglio inter
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