Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 6:34 min. • July 8th, 2025
La purificazione di affinità tandem è uno schema di purificazione sequenziale per isolare complessi proteici dalle cellule per studiare le interazioni proteina-proteina.
Per iniziare, prendi una coltura cellulare che esprime proteine di interesse marcate con epitopi. Le proteine formano un complesso all'interno della cellula. Una delle proteine del complesso contiene uno Strep-tag, mentre l'altra è marcata con un FLAG-tag. Si tratta di piccoli tag di affinità basati su sequenze peptidiche sintetiche.
Rimuovere il terreno e aggiungere una soluzione detergente per lisare le cellule. Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante contenente il complesso proteico bersaglio e altre proteine cellulari.
Aggiungere le perle di streptococco - perle di agarosio rivestite con streptavidina - e incubare. Lo Streptotag del complesso proteico si lega alla streptavidina. Centrifugare per raccogliere le perle legate al complesso proteico. Lavare per rimuovere eventuali proteine cellulari contaminanti.
Aggiungere un tampone di eluizione contenente destiobiotina, un derivato della biotina, che sposta il complesso proteico legandosi in modo competitivo alla streptavidina. C
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