Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

La purificazione di affinità tandem è uno schema di purificazione sequenziale per isolare complessi proteici dalle cellule per studiare le interazioni proteina-proteina.

Per iniziare, prendi una coltura cellulare che esprime proteine di interesse marcate con epitopi. Le proteine formano un complesso all'interno della cellula. Una delle proteine del complesso contiene uno Strep-tag, mentre l'altra è marcata con un FLAG-tag. Si tratta di piccoli tag di affinità basati su sequenze peptidiche sintetiche.

Rimuovere il terreno e aggiungere una soluzione detergente per lisare le cellule. Centrifugare per rimuovere i detriti cellulari. Raccogliere il surnatante contenente il complesso proteico bersaglio e altre proteine cellulari.

Aggiungere le perle di streptococco - perle di agarosio rivestite con streptavidina - e incubare. Lo Streptotag del complesso proteico si lega alla streptavidina. Centrifugare per raccogliere le perle legate al complesso proteico. Lavare per rimuovere eventuali proteine cellulari contaminanti.

Aggiungere un tampone di eluizione contenente destiobiotina, un derivato della biotina, che sposta il complesso proteico legandosi in modo competitivo alla streptavidina. Centrifugare per ottenere un surnatante contenente il complesso proteico eluito.

Aggiungere FLAG-beads - perle di agarosio rivestite con anticorpi anti-FLAG - e incubare. Il tag FLAG del complesso proteico si lega all'anticorpo. Centrifugare per raccogliere le perle legate al complesso proteico.

Aggiungere un tampone di eluizione contenente peptide FLAG libero. Il peptide si lega in modo competitivo all'anticorpo e sposta il complesso proteico legato. Centrifuga per eluire il complesso proteico purificato.

Valutare la presenza di entrambe le proteine nell'eluito per confermare l'interazione tra le proteine di interesse.

Dopo che il lisato cellulare e le miscele di liquame STREP-bead sono state incubate per 2 ore, centrifugarle a 1,1500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Conservare il surnatante come "STREP AP flow-through" e conservarlo a 4 gradi Celsius.

Aggiungere 500 microlitri di STREP AP Wash Buffer 1 alle perline. Nutare le perle e la miscela di tampone per 5 minuti a 4 gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con 500 microlitri di STREP AP Wash Buffer 1.

Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di microsfere in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ridurre lo sfondo proteico. Lavare una quarta volta con STREP AP Wash Buffer 1. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di Wash Buffer 2.

Equilibrare le perle capovolgendo i tubi, quindi centrifugare a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Scartare il surnatante. Eluire la proteina di interesse con 50 microlitri di tampone di eluizione STREP. Vortice a 800 giri/min per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Centrifugare le perline a 1500 volte g per 1 minuto a 4 gradi Celsius. Raccogli il surnatante. Questa frazione corrisponde al campione di "eluizione STREP AP".

Conservare la frazione di perle a 4 gradi Celsius per una seconda eluizione. Aliquotare il 10% dell'eluizione STREP AP per la colorazione con argento e/o western blotting.

Per aumentare la quantità di materiale di partenza per la successiva immunoprecipitazione FLAG, la prima e la seconda eluizione STREP possono essere raggruppate insieme per un recupero più efficiente dell'eluizione FLAG.

Iniziare questa procedura utilizzando una punta per pipetta a bocca larga per trasferire la quantità appropriata di soluzione di perline FLAG in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 microlitri di FLAG Wash Buffer alle perline.

Centrifugare a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con il tampone di lavaggio FLAG. Dopo il terzo lavaggio, rimuovere il surnatante e risospendere le perle nel tampone di lavaggio FLAG fino a un volume finale di n volte 16 microlitri, dove n è il numero di campioni.

Aggiungere 16 microlitri di liquame di perle FLAG all'eluizione STREP AP rimanente e nutare per una notte a 4 gradi Celsius. Dopo un'incubazione notturna dell'impasto di perle FLAG e dell'eluizione STREP AP, procedere con l'immunoprecipitazione FLAG.

Abbassare la sospensione delle perline FLAG a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Salvare il surnatante come "FLAG IP flow-through" e conservarlo a 4 gradi Celsius.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio FLAG alle perline. Nutare per 5 minuti a 4 gradi Celsius e centrifugare a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Eliminare il surnatante e lavare nuovamente con 500 microlitri di tampone di lavaggio FLAG.

Dopo il terzo lavaggio, trasferire la soluzione di perline proteiche in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per ridurre lo sfondo. Lavare una quarta volta con il tampone di lavaggio FLAG. Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere alle perle 30 microlitri di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 nanogrammi per microlitro di peptide FLAG. Vortice a 800 giri/min per due ore a 4 gradi Celsius.

Dopo due ore, far girare la sospensione a 1.500 volte g per 2 minuti a 4 gradi Celsius. Raccogli il surnatante e conservalo a 4 gradi Celsius come "eluizione IP FLAG".