Risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina a livello atomico

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare, o NMR, consente il rilevamento dell'interazione proteina-proteina a livello atomico.

Per studiare le interazioni tra proteine globulari ed elicoidali, etichettare proteine globulari purificate wild-type o mutanti con ¹⁵N, un isotopo dell'azoto. In una provetta NMR, mescolare le proteine globulari marcate e le proteine elicoidali non marcate in un solvente contenente uno standard NMR. Inserire il tubo nello spettrometro NMR.

I magneti dello spettrometro generano un forte campo magnetico, allineando i ¹⁵nuclei proteici globulari marcati con N parallelamente al campo. Un impulso a radiofrequenza, o RF, eccita i ¹⁵N-nuclei per allinearsi in modo antiparallelo al campo.

La frequenza di risonanza è la frequenza di impulso richiesta per la transizione di ¹⁵N nuclei tra i due stati. La normalizzazione della frequenza di risonanza di ¹⁵N allo standard NMR misura lo spostamento chimico di ¹⁵N.

Il campo magnetico viene regolato per allineare i nuclei ¹H, legati a ¹⁵N, parallelamente al campo. Gli impulsi RF vengono regolati e viene registrato lo spostamento chimico di ¹H.

Durante le interazioni proteiche, l'ambiente chimico che circonda i residui di amminoacidi interagenti cambia, alterando i ^{legami chimici 15 N-1}H e i corrispondenti cambiamenti chimici. Traccia i ¹⁵spettri NMR ^N-1H.

Senza proteine elicoidali, le proteine globulari wild-type mostrano picchi spettrali ben risolti. Quando le proteine globulari elicoidali e wild-type interagiscono, il picco spettrale si riduce. Al contrario, l'incubazione di proteine elicoidali con proteine globulari mutanti provoca la ricomparsa dei picchi spettrali, indicando l'assenza di interazione tra di loro.

Attivare il flusso d'aria con il comando di espulsione "ej". Questo farà salire il campione dal magnete. Ora, posiziona il campione all'interno di una rotella sopra il magnete nell'apertura. Inserire con il comando "ij". Attendere che il campione si depositi all'interno del magnete prima di procedere.

Crea un nuovo set di dati utilizzando il comando "edc" e carica i parametri NMR standard del protone selezionando l'esperimento "ZGPR". Compila i campi nome, numero dell'esperimento e numero della cartella dei dati elaborati.

Selezionare il solvente nel campo "Imposta solvente" e fare clic su "Esegui 'getprosol'" per leggere la testa della sonda standard e i parametri dipendenti dal solvente. Bloccare il campione sul solvente deuterato utilizzando il comando "Blocca" e attendere che abbia terminato lo spazzamento e raggiunga il blocco.

Correggere la frequenza di risonanza del magnete sintonizzando il campione utilizzando il comando di sintonizzazione automatica "atma". Monitorare la curva di oscillazione fino al completamento della sintonizzazione automatica.

Spessorare il campo magnetico utilizzando "TOPSHIM". Lo spessore consente di regolare il campo magnetico per ottenere l'uniformità intorno al campione. È buona norma memorizzare gli stessi valori con il comando "wsh" e leggerli utilizzando "rsh" prima di topshim se si utilizzano campioni uguali o simili.

Ora, regola il guadagno del ricevitore con il comando "rga" per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore. Posizionare il centro dello spettro sull'offset di risonanza dell'acqua e impostare l'impulso protonico a 90 gradi ad alta potenza utilizzando "calibo1p1".

Raccogli lo spettro protonico usando il comando Zero Go "zg" ed elabora con "efp". Ciò include la moltiplicazione esponenziale, il decadimento a induzione libera che incorpora l'allargamento della linea, la trasformazione di Fourier del FID e "pk" per applicare la correzione di fase.

Applica la correzione di fase automatica "apk" e la correzione automatica della linea di base "absn" utilizzando l'opzione polinomiale senza integrazione. Creare un nuovo set di dati per l'esperimento SOFAST HMBC selezionando "SFHMQC3GPPH" nell'esperimento.

Copiare P1 e O1 ottimizzati dallo spettro protonico e popolare gli impulsi dipendenti da P1 utilizzando il comando "getprosol 1H p1 plw1" dove P1 è il valore P1 ottimizzato e plw1 è il livello di potenza per P1. Ora, ottimizza la costante CNST54 per impostare l'offset per lo spostamento chimico dell'ammide. Inoltre, ottimizza CNST55 per definire la larghezza di banda al fine di comprendere le regioni spettrali di interesse, consentendo di ottimizzare il guadagno del ricevitore.

Per selezionare questi parametri, estrarre il primo FID dallo spettro bidimensionale e cercare il segnale osservato per definirli. Inoltre, varia il ritardo di rilassamento, il numero di scansioni e le scansioni fittizie per ottenere una sensibilità del segnale accettabile con il comando "gs", che consente a go e scan di monitorare la qualità dei dati in tempo reale. Infine, registra gli spettri utilizzando Zero Go "zg".