Utilizzo del phage display per selezionare proteine con elevata affinità per una proteina target

Inizia la visualizzazione dei fagi aggiungendo una libreria di fagi ai pozzetti di una piastra a più pozzetti, rivestita con la proteina bersaglio. La libreria dei fagi contiene fagi geneticamente modificati, ognuno dei quali mostra una singola variante proteica fusa con una proteina di rivestimento sulla sua superficie. Incubare, consentendo al fago e alle proteine bersaglio di interagire.

I fagi con proteine con un'elevata affinità per la proteina bersaglio si legano alla proteina bersaglio. Lavare con un tampone, rimuovendo i fagi non legati. Aggiungere una soluzione acida, interrompendo le interazioni tra fago e proteina bersaglio, rilasciando fagi nella soluzione. Neutralizzare il pH della soluzione utilizzando un tampone, mantenendo la stabilità dei fagi.

Trasferisci i fagi in una provetta nuova. Incubare con una soluzione bloccante contenente proteine, prevenendo interazioni aspecifiche.

Trasferire i fagi in una sospensione di E. coli che si divide attivamente, infettando i batteri e avviando il ciclo di replicazione dei fagi. Integrare con fagi helper, che infettano i batteri, fornendo le proteine del mantello necessarie per confezionare i fagi della progenie. Trasferire la sospensione in un mezzo selettivo, consentendo la crescita di batteri infetti da fagi.

I fagi della progenie alla fine vengono rilasciati nel medium. Centrifuga. Raccogli il surnatante contenente i fagi. Aggiungere una soluzione di precipitazione, concentrando le particelle di fago. Centrifuga. Risospendere il pellet di fago in un tampone, ottenendo una sospensione omogenea.

Eseguire i successivi cicli di selezione dei fagi; ripetere il legame della proteina fago-bersaglio, l'eluizione con una fase di rigore del lavaggio del tampone aumentata e le fasi di amplificazione e centrifugazione, con conseguente arricchimento dei pool di fagi che mostrano proteine con elevata affinità per la proteina bersaglio.

Scongela la biblioteca dei fagi sul ghiaccio. Quindi, diluiscilo a 100 volte la diversità della libreria in PBS. Aggiungere la soluzione di polietilenglicole/cloruro di sodio a 1/5 del volume diluito della libreria e incubare la soluzione con ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare la soluzione a 11.000 volte g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e centrifugarlo per altri due minuti per estrarre il surnatante rimanente e concentrare il pellet di fago.

Risospendere delicatamente il pellet di fago in un millilitro di tampone PBT per proteina bersaglio da analizzare, in genere, quattro in totale. Aggiungere 100 microlitri di libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito nella piastra di controllo. Incubarlo a temperatura ambiente per un'ora con agitazione orbitale a 300 giri/min.

Gettare il tampone PB dalla piastra di destinazione nel lavandino e asciugare la piastra su carta assorbente. Trasferire tutti i 100 microlitri della libreria di fagi nella piastra di controllo in ciascun pozzetto rivestito della piastra target. Incubarlo a temperatura ambiente per un'ora con agitazione orbitale a 300 giri/min.

Quindi, rimuovere la libreria di fagi dalla piastra e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con un tampone PT. Capovolgere la piastra e picchiettare su un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce di tampone. Aggiungere 100 microlitri di acido cloridrico 0,1 molare a ciascun pozzetto rivestito per eluire il fago. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione orbitale a 300 giri/min.

Successivamente, neutralizzare il pH aggiungendo 12,5 microlitri di Tris cloridrato a pH 11 a un molare a ciascun pozzetto rivestito. Trasferire il fago eluito da tutti gli otto pozzetti in una singola provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pipettare su e giù durante il trasferimento per rendere omogenee le soluzioni e aspirare tutto il liquido dai pozzetti. Aggiungere il 10% di BSA al fago eluito per ottenere la concentrazione finale dell'1%.

Conservare la provetta per microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Questo è l'output rotondo. Preparare una coltura di semi per la coltura dell'input fagico per il successivo ciclo di selezione inoculando cinque millilitri di coltura di semi di 2YT/tetraciclina con una colonia isolata di E. coli da una piastra di agar.

Incubarlo per una notte a 37 gradi Celsius con agitazione orbitale di 200 giri/min. Diluire la proteina bersaglio nelle provette del secondo e del terzo giro con una quantità appropriata di PBS. Prelevare metà del contenuto della provetta del secondo e del terzo ciclo e rivestire quattro pozzetti per proteina bersaglio in una piastra di legame a 96 pozzetti per il ciclo successivo.

Successivamente, utilizzare metà dell'output rotondo per inoculare tre millilitri di celle in fase mid-log. Incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min. Aggiungere M13KO7 Helper Phage a una concentrazione finale di 10 miliardi di pfu per millilitro. Incubarlo nuovamente a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione orbitale a 200 giri/min.

Dopo un'ora, trasferire tutti e tre i millilitri di coltura in 30 millilitri di soluzione 2YT/Carbenicillina/Kanamicina. Coltiva durante la notte a 37 gradi Celsius con scuotimento orbitale di 200 giri/min.