Immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine bersaglio sul DNA genomico

Per identificare i siti di legame di una proteina bersaglio sul DNA, iniziare con cellule precursori di oligodendrociti contenenti una proteina bersaglio reticolata a specifiche sequenze di DNA nella cromatina.

Trattare le cellule con un tampone di lisi contenente inibitori della proteasi. Il tampone di lisi lisa le cellule, mentre gli inibitori inattivano le proteasi per mantenere l'integrità dei complessi proteina-cromatina.

Sonicare il contenuto per tagliare i complessi in frammenti di cromatina più piccoli, con alcuni che trattengono la proteina bersaglio.

Centrifugare per pellettare i componenti della cella e trasferire il surnatante contenente frammenti di cromatina in una provetta nuova. Incubare con anticorpi anti-bersaglio che si legano specificamente alla proteina bersaglio sui frammenti di cromatina.

Integrare la provetta con microsfere magnetiche rivestite di proteina A che si legano alla regione Fc degli anticorpi pre-legati. Applicare un campo magnetico per precipitare selettivamente le proteine bersaglio legate agli anticorpi complessate con frammenti di cromatina.

Trattare i complessi di perline con un tampone di eluizione ad alto contenuto di sale per interrompere le interazioni proteina-cromatina e rilasciare il DNA nudo senza proteine associate.

Utilizzare solventi organici per estrarre il DNA. Aggiungi un tampone di amplificazione ed esegui una reazione a catena della polimerasi per amplificare i frammenti di DNA. Dopo l'amplificazione, analizzare la sequenza di DNA.

Confrontare la sequenza dei prodotti amplificati con la sequenza genomica del DNA della cellula. Trova la regione con una corrispondenza di sequenza tra il frammento e il DNA genomico, correlata con i siti di legame delle proteine.

Dopo aver contato in un emocitometro, aggiungere 20.000 OPC purificati in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare OPC per la reazione ChIP. Quindi, aggiungere 27 microlitri di formaldeide al 36,5% a temperatura ambiente per 10 minuti. Questo sistemerà le celle.

Dopo 10 minuti, aggiungere 50 microlitri di glicina molare 2,5 sulle celle fisse per 5 minuti a temperatura ambiente. L'aggiunta della glicina fermerà la reticolazione DNA-proteina. Quindi, lavare le cellule reticolate con 1 millilitro di tampone HBSS con cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, centrifugare le celle in una centrifuga pre-raffreddata a 300 volte g a 4 gradi Celsius.

Dopo aver reticolato gli OPC purificati, le cellule reticolate devono essere lavate con una soluzione HBSS ghiacciata e le restanti fasi di ChIP devono essere eseguite a 4 gradi. In caso contrario, l'anticorpo non può precipitare correttamente il DNA genomico.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di tampone di lisi completo al pellet cellulare e lasciare in ghiaccio per 5 minuti. Successivamente, pipettare 75 microlitri di tampone HBSS ghiacciato con cocktail di inibitori della proteasi. Quindi, tagliare la cromatina del lisato cellulare in un sistema di sonicazione pre-raffreddato con cinque cicli di 30 secondi ON e 30 secondi OFF.

Una volta che la cromatina è stata tranciata, centrifugare il lisato cellulare a 14.000 volte g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, raccogliere il surnatante. Quindi, diluire 100 microlitri della cromatina tranciata con un volume uguale del tampone ChIP ghiacciato con inibitore della proteasi.

Quindi, aggiungere 1 microlitro di anticorpo anti-olig2 di coniglio a 180 microlitri di cromatina tranciata diluita. Incubare i tubi su una ruota rotante per 16 ore a 4 gradi Celsius a 40 giri al minuto. Quindi, aggiungere 10 microlitri di perle rivestite di proteina A prelavate al tubo di reazione ChIP in una cella frigorifera. Ancora una volta, incubare le provette ChIP a 4 gradi Celsius per altre 2 ore sulla ruota rotante.

Dopo 2 ore, lasciare la provetta di reazione ChIP sulla rastrelliera magnetica per un minuto. Quindi, lavare il pellet di perline con 100 microlitri di quattro tamponi di lavaggio ciascuno per 4 minuti su una ruota rotante a 4 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone di eluizione al pellet di perline. Incubare la provetta di reazione a 65 gradi Celsius per 4 ore.

Una volta che il DNA a doppio filamento è denaturato, defosforilare l'estremità 3-prime del DNA a filamento singolo aggiungendo fosfatasi alcalina di gamberetti. Quindi, aggiungere la coda di poli(T) al DNA a filamento singolo utilizzando la deossinucleotidiltransferasi terminale. Quindi, ricuocere il primer del DNA poli-(dA) sul modello di DNA a filamento singolo. Quindi, amplifica la libreria di sequenze ChIP utilizzando primer diretti e inversi per l'indicizzazione.

Il numero di cicli di PCR per la preparazione della libreria dipende dalla quantità di DNA iniziale. Una buona preparazione della libreria richiede una quantificazione accurata della quantità di DNA in ingresso. Troppi o troppo pochi cicli di PCR possono influenzare la concentrazione della libreria e la complessità, portando ad artefatti PCR.

Utilizzare le microsfere paramagnetiche per selezionare i frammenti che vanno da 250 a 500 coppie di basi dalla libreria di sequenze ChIP amplificata con PCR. Utilizzare un dispositivo di elettroforesi capillare ChIP microfluidica per esaminare la qualità della libreria di sequenze ChIP selezionata.