Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA

Il fattore di trascrizione, TF, è una proteina che si lega alla regione specifica del DNA di un gene e regola la trascrizione.

Per misurare le interazioni TF-DNA mediante anisotropia di fluorescenza, prendere una piastra a più pozzetti. Aggiungere al pozzetto il gel fuso miscelato con una soluzione tampone, contenente concentrazioni note di DNA di riferimento marcato con fluorofori comprendente un sito di legame TF e una maggiore concentrazione di molecole di TF, e incubare.

Poiché il DNA di riferimento marcato si distribuisce nel gel, una maggiore concentrazione di molecole di TF assicura che tutte le molecole di DNA siano legate al TF. Aggiungere una soluzione tamponata contenente DNA concorrente non marcato con una mutazione a punto singolo.

Analizza il gel della piastra utilizzando la microscopia anisotropia a fluorescenza ad alte prestazioni.

La luce polarizzata eccita il fluoroforo di riferimento legato al DNA, che si riorienta a causa del tumbling molecolare ed emette luce depolarizzata multidirezionale, un fenomeno chiamato anisotropia di fluorescenza, FA.

Dopo il legame con il TF, il peso molecolare del fluoroforo legato al DNA di riferimento aumenta e cade più lentamente, emettendo più luce polarizzata che aumenta la FA.

Il DNA concorrente non marcato si diffonde attraverso la matrice di gel nel tempo, formando un gradiente di concentrazione da alto a basso. Una maggiore concentrazione di DNA concorrente non marcato sostituisce il DNA di riferimento marcato, legandosi al TF. Gli oligomeri di riferimento marcati rilasciati cadono più velocemente, diminuendo l'FA.

Traccia il gradiente di concentrazione del DNA del fluoroforo e del DNA concorrente nel tempo, che diminuisce man mano che più molecole di DNA concorrenti sostituiscono il DNA di riferimento.

Per preparare i pozzetti di titolazione e calibrazione di una piastra a 96 pozzetti, trasferire due aliquote di gel stock in un agitatore per incubatore a 75 gradi Celsius.

Per ogni pozzetto di titolazione, aggiungere 1,4 nanomoli di DNA di riferimento, la proteina del fattore di trascrizione a una concentrazione finale compresa tra 20 e 60 nanomoli, 0,2 millimolari di DTT e il tampone di legame a 240 microlitri di gel fuso.

Mescolare accuratamente capovolgendo e agitando il tubo. Quindi, pipettare lentamente 200 microlitri per pozzetto di gel contenente DNA nei pozzetti di titolazione designati di una piastra a 96 pozzetti. Per ogni pozzetto di calibrazione, aggiungere 5 nanomoli di colorante blu del Nilo a 240 microlitri di gel fuso. Evitando la formazione di bolle d'aria, pipettare lentamente 200 microlitri della soluzione di gel contenente colorante in cinque o sei pozzetti della piastra a 96 pozzetti.

Posizionare il gel su una superficie perfettamente orizzontale e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e altri 10 minuti a 4 gradi Celsius. Utilizzare un lettore di piastre multipozzetto per verificare l'omogeneità dei livelli di altezza del gel nei diversi pozzetti della piastra.

Per preparare la soluzione di DNA concorrente, in primo luogo, combinare il DNA di riferimento marcato, la proteina e il tampone di legame concentrato triplo. Quindi, mescolare 20 microlitri della soluzione con 40 microlitri di ciascuna delle soluzioni di DNA concorrente ricotto.

Per ogni pozzetto di calibrazione, combinare le quantità appropriate di una delle soluzioni di DNA concorrente ricotte e il tampone di legame concentrato triplice contenente una soluzione di colorante blu del Nilo da 15 millimolari. Infine, aggiungi 50 microlitri di soluzioni miste della concorrenza sopra i gel il più contemporaneamente possibile.

Per iniziare l'acquisizione dell'immagine, posizionare la piastra a 96 pozzetti sul tavolino del microscopio. Quindi, prendi serie temporali di immagini z-stack di pozzetti fino al completo distacco della proteina dal DNA di riferimento.

Eseguire il saggio di titolazione secondo il manoscritto. Quindi, utilizzare il software HiP-FA per creare curve di titolazione per le singole sequenze della concorrenza. Quindi, fare clic sul pulsante "Esporta" per ottenere la costante di dissociazione e la concentrazione della proteina attiva in ciascun pozzetto di titolazione.