Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:00 min. • July 8th, 2025
Il fattore di trascrizione, TF, è una proteina che si lega alla regione specifica del DNA di un gene e regola la trascrizione.
Per misurare le interazioni TF-DNA mediante anisotropia di fluorescenza, prendere una piastra a più pozzetti. Aggiungere al pozzetto il gel fuso miscelato con una soluzione tampone, contenente concentrazioni note di DNA di riferimento marcato con fluorofori comprendente un sito di legame TF e una maggiore concentrazione di molecole di TF, e incubare.
Poiché il DNA di riferimento marcato si distribuisce nel gel, una maggiore concentrazione di molecole di TF assicura che tutte le molecole di DNA siano legate al TF. Aggiungere una soluzione tamponata contenente DNA concorrente non marcato con una mutazione a punto singolo.
Analizza il gel della piastra utilizzando la microscopia anisotropia a fluorescenza ad alte prestazioni.
La luce polarizzata eccita il fluoroforo di riferimento legato al DNA, che si riorienta a causa del tumbling molecolare ed emette luce depolarizzata multidirezionale, un fenomeno chiamato anisotropia di fluorescenza, FA.
Dopo il legame con il TF, il peso molecolare del fluoroforo legato al DNA di riferimento aumenta e cade più lentamente,
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici