Saggio di repressione genica reporter per studiare la regolazione traduzionale di un gene bersaglio

Le proteine leganti l'RNA, RBP, funzionano come regolatori post-trascrizionali legandosi alla regione di inizio della traduzione, TIR, dell'mRNA e reprimendo la traduzione.

Per studiare le interazioni RNA-RBP attraverso la repressione traduzionale di un gene reporter, prendere una coltura cellulare batterica contenente due plasmidi: il sito di legame e i plasmidi RBP.

Il plasmide del sito di legame codifica per un gene reporter fluorescente. Dopo la trascrizione, il TIR dell'mRNA risultante contiene un sito di legame dei ribosomi e una struttura a forcina, con una sequenza riconosciuta dalle RBP.

I ribosomi si legano al sito di legame sull'mRNA e destabilizzano la struttura a forcina, portando alla traduzione dell'mRNA e alla formazione di proteine reporter fluorescenti. Il plasmide RBP esprime un RBP chimerico fuso con una diversa proteina fluorescente. Un promotore inducibile controlla l'espressione della proteina chimerica.

Aggiungi l'induttore, che attiva un fattore di trascrizione che si lega al promotore, inducendo l'espressione proteica chimerica. L'RBP della proteina chimerica si lega alla struttura a forcina. Questo impedisce al ribosoma di legarsi all'mRNA, inibendo la traduzione della proteina reporter.

Con l'aumentare della concentrazione dell'induttore, la produzione di RBP aumenta, con conseguente maggiore inibizione competitiva del legame ribosomiale all'mRNA.

Misura i diversi segnali di fluorescenza dalle proteine chimeriche e reporter. Tracciare i segnali, ottenendo la curva dose-risposta.

Con l'aumento della produzione di RBP mediato dall'induttore, la repressione traduzionale riduce la concentrazione della proteina reporter, confermando l'interazione RNA-RBP.

Trasformare i plasmidi preparati in cellule batteriche chimicamente competenti che contengono già un plasmide RBP-mCeruleo. Per risparmiare tempo, piastrate le cellule utilizzando un pipettatore a 8 canali su piastre a 8 corsie contenenti agar Luria-Bertani con antibiotici pertinenti. Le colonie dovrebbero apparire in 16 ore a 37 gradi Celsius.

Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformante e trasferirla in piastre a 48 pozzetti contenenti 1,5 millilitri di LB con antibiotici appropriati. Far crescere le cellule per un periodo di 18 ore a 37 gradi Celsius agitando a 250 giri/min. Conservare le scorte di glicerolo durante la notte a -80 gradi Celsius in piastre a 96 pozzetti.

Al mattino, programmare il robot per riscaldare 180 microlitri di terreno semi-povero, o SPM, in piastre a 96 pozzetti. Programmare il robot per preparare la piastra induttrice.

In una piastra pulita a 96 pozzetti, preparare i pozzetti con SPM composto da 95% BA e 5% LB. Il numero di pozzetti corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori. Aggiungere C4-HSL ai pozzetti della piastra induttore che conterrà la massima concentrazione dell'induttore.

Successivamente, programmare il robot per diluire in serie il terreno da ciascuno dei pozzetti a più alta concentrazione in 23 concentrazioni più basse che vanno da 0 a 218 nanomolari. Il volume di diluizione di ciascun induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi.

Per diluire i ceppi notturni, programmare il robot in modo che diluisca di un fattore 10 mescolando 20 microlitri di batteri con 180 microlitri di SPM in piastre a 48 pozzetti. Quindi, diluire nuovamente di un fattore 10 prelevando 20 microlitri dalla soluzione diluita nella piastra di deformazione pre-preparata adatta per le misure fluorescenti.

Ora, programmate il robot per aggiungere l'induttore diluito dalla piastra induttrice alle piastre a 96 pozzetti con i ceppi diluiti in base alle concentrazioni finali. Agitare le piastre a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per 6 ore. Durante questo periodo, è possibile misurare la densità ottica o OD a 595 nanometri, nonché la fluorescenza mCherry e mCerulea tramite un lettore di piastre ogni 30 minuti.