Misurazione dell'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio utilizzando duplex di RNA marcati con biotina

Le proteine con attività di RNA elicasi possono aiutare a svolgere e separare le singole molecole di RNA in un duplex di RNA.

Per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina, prendere provette contenenti una miscela di duplex di RNA marcati con biotina con una sporgenza di 5', ATP e trappole di RNA, filamenti non marcati complementari ai filamenti biotinilati dei duplex.

Aggiungere la proteina con attività elicasica a ciascuna provetta e incubare per durate diverse. La proteina si lega alla sporgenza di 5' dei duplex.

Utilizzando molecole di ATP, rompe i legami idrogeno tra due filamenti duplex, provocando il loro svolgimento e il rilascio dell'RNA biotinilato a singolo filamento. Le trappole dell'RNA interagiscono con i filamenti marcati con biotina, impedendo la ricottura con i filamenti separati.

Terminare la reazione utilizzando un buffer di terminazione.

Caricare i campioni in diversi pozzetti di un gel di poliacrilammide nativo. Eseguire l'elettroforesi. L'RNA a singolo filamento a basso peso molecolare si muove più velocemente dei duplex ad alto peso molecolare. Questo spostamento di mobilità genera due bande distinte.

Tamponare il gel su una membrana di nylon, trasf