Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

Le rotture del doppio filamento di DNA indotte dalle radiazioni, o DSB, avviano il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA nel sito danneggiato, attivando la riparazione del DNA.

Per rilevare le proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti DSB utilizzando l'immunofluorescenza indiretta, prendere vetrini coprioggetti contenenti cellule epiteliali. Irradiare un sottoinsieme delle cellule. Incubare, consentendo alle cellule di controllo non irradiate e irradiate di crescere per tempi specifici.

Trattare con un tampone per estrarre i nuclei cellulari. Fissare i nuclei cellulari per preservarne la morfologia. Trattare con una soluzione bloccante per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi primari.

Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio le due proteine di riparazione del DNA. Gli anticorpi si legano alle rispettive proteine.

Incubare con anticorpi secondari marcati rispettivamente con fluorofori rossi e verdi. Gli anticorpi secondari, specifici per ciascun anticorpo primario, si legano ai loro bersagli. Aggiungere un supporto di montaggio contenente DAPI su un vetrino. Montare i vetrini coprioggetti su di esso per l'imaging.

DAPI – un colorante legante il DNA – si lega ai solchi minori ricchi di AT del DNA a doppio filamento, controcolorando i nuclei. Visualizzare i nuclei cellulari utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Rispetto ai nuclei cellulari non irradiati, i nuclei irradiati mostrano focolai multipli di γH2AX che diminuiscono nel tempo, indicando una progressiva riparazione del DNA nelle cellule cresciute per periodi più lunghi.

I segnali di fluorescenza rossi e verdi sovrapposti appaiono in giallo, indicando la co-localizzazione di γH2AX e 53BP1 nel sito DSB dopo l'irradiazione.

Iniziate coltivando 40.000 cellule HeLa in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con un vetrino coprioggetti rotondo da 18 millimetri all'80% di confluenza. Dopo aver esposto le cellule all'irradiazione gamma 4 Gray, lavarle due volte con 1 millilitro di PBS. Quindi, rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri di NEB a ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere l'NEB.

Tieni presente che il tempo di incubazione può variare a seconda della linea cellulare, ma generalmente non dovrebbe superare i due minuti. Lavare le celle con 1 millilitro di PBS. Quindi, rimuovere completamente il PBS e aggiungere 200 microlitri di PFA al 4% in ciascun pozzetto per la fissazione cellulare.

Incubare le cellule per 10 minuti a 4 gradi Celsius, quindi rimuovere il PFA e aggiungere 1 millilitro di PBS a ciascun pozzetto. Rimuovere completamente il PBS, quindi aggiungere 200 microlitri di soluzione bloccante a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 2 ore a temperatura ambiente, o da 16 a 18 ore a 4 gradi Celsius.

Diluire l'anticorpo primario in un tampone di diluizione e agitarlo fino a quando non è ben miscelato. In una scatola per l'umidità, far aderire un pezzo di parafilm e aggiungere 10 microlitri di anticorpi primari in una sola goccia. Allineare un bordo del vetrino coprioggetti dal pozzetto con la goccia e abbassarlo lentamente sul parafilm, distribuendo il liquido. Incubare il vetrino coprioggetti per 2 ore a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, lavare i vetrini coprioggetti tre volte in PBS per 1 minuto per lavaggio. Diluire l'anticorpo secondario in tampone di diluizione e vortex fino a quando non è ben miscelato. Applicare 10 microlitri di anticorpi secondari su ciascun vetrino coprioggetti come precedentemente descritto e incubare per 2 ore a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.

Lavare i vetrini coprioggetti tre volte con PBS e una volta con acqua, per 1 minuto per lavaggio. Quindi, montarli su vetrini con un supporto di montaggio a base di glicerolo contenente DAPI. Sigillare i vetrini coprioggetti con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti. Posizionare una goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo 60X e utilizzare DAPI per localizzare i nuclei attraverso l'oculare.

Per l'acquisizione di immagini XYZ, aprire il software di acquisizione e impostare il "Tipo di scanner" su "Galvano", la "Modalità scanner" su "Andata e ritorno" e la dimensione dell'immagine "512 x 512". Nel pannello PMT, impostare la modalità su VBM, la media su Frame e la scansione sequenziale su Line. Quindi, impostare i rilevatori di colorante e calore. Imposta il canale 1 su DAPI e SD1, il canale due su Alexa Fluor 488 e HSD3 e il canale 3 su Alexa Fluor 647 e HSD4. Selezionare "ON" in "Z".

Per regolare l'immagine dal vivo, premere il pulsante Live nella finestra Live e regolare la messa a fuoco. Quindi, utilizzare la finestra "Strumento PMT" per impostare l'intensità, la sensibilità, il guadagno e l'offset del laser. Per le pile Z, seleziona Inizio a fine e 15 sezioni. Selezionare la cartella in cui salvare le immagini e premere il pulsante LSM Start per avviare l'acquisizione. Al termine, premere il pulsante Series Done per completare l'acquisizione dell'immagine.