JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 5:42 min. • July 8th, 2025
Le rotture del doppio filamento di DNA indotte dalle radiazioni, o DSB, avviano il reclutamento delle proteine di riparazione del DNA nel sito danneggiato, attivando la riparazione del DNA.
Per rilevare le proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti DSB utilizzando l'immunofluorescenza indiretta, prendere vetrini coprioggetti contenenti cellule epiteliali. Irradiare un sottoinsieme delle cellule. Incubare, consentendo alle cellule di controllo non irradiate e irradiate di crescere per tempi specifici.
Trattare con un tampone per estrarre i nuclei cellulari. Fissare i nuclei cellulari per preservarne la morfologia. Trattare con una soluzione bloccante per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi primari.
Aggiungere anticorpi primari che hanno come bersaglio le due proteine di riparazione del DNA. Gli anticorpi si legano alle rispettive proteine.
Incubare con anticorpi secondari marcati rispettivamente con fluorofori rossi e verdi. Gli anticorpi secondari, specifici per ciascun anticorpo primario, si legano ai loro bersagli. Aggiungere un supporto di montaggio contenente DAPI su un vetrino. Montare i vetrini coprioggetti su di esso per l'imaging.
DAPI – un
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