Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

Per isolare le proteine leganti l'RNA, o RBP - regolatori post-trascrizionali - è necessaria una sospensione di piccole sonde di RNA contenenti un elemento ricco di adenilato-uridilato, o ARE - una sequenza riconosciuta dalle RBP bersaglio. Le sonde di RNA sono marcate con destiobiotina, un derivato della biotina.

Aggiungi perle magnetiche rivestite di streptavidina, una proteina con un'affinità per la biotina. Incubare sotto agitazione per evitare che le perle si depositino. L'RNA marcato con destiobiotina si lega alla streptavidina, immobilizzando così l'RNA sulle perline.

Sotto il campo magnetico, le perle si raccolgono sul lato del tubo. Rimuovere il surnatante. Risospendere le microsfere in un tampone che fornisca un pH ottimale per il legame RBP-RNA.

Dopo l'esposizione al magnete, le perle si raccolgono sul lato del tubo. Scartare il surnatante. Risospendere le perle in una soluzione contenente le RBP bersaglio e incubare sotto agitazione.

Le RBP bersaglio possiedono motivi di riconoscimento dell'RNA che riconoscono la sequenza ARE e si legano all'RNA, formando così un complesso RNA-proteina immobilizzato sulle perline.

Sotto il campo magnetico, le perle si muovono verso il m