JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 2:43 min • July 8th, 2025
Le interazioni proteina-fosfolipide sulla membrana cellulare sono cruciali per la regolazione di diversi processi cellulari.
Per rilevare le interazioni proteina-fosfolipide bersaglio in vitro utilizzando la citometria a flusso quantitativa, prelevare una provetta contenente una concentrazione desiderata di mimica della membrana cellulare - vescicole fosfolipidiche marcate con colorante lipofilo di dimensioni micron - in tampone.
Aggiungere in soluzione una concentrazione appropriata di diverse proteine bersaglio marcate in fluorescenza.
Iniettare la sospensione nel citometro a flusso. Impostare i parametri del sistema fluidico su una velocità di flusso bassa per consentire un tempo sufficiente per le interazioni proteina-fosfolipidi.
Quando le proteine marcate in fluorescenza e le vescicole fosfolipidiche interagiscono nel canale di flusso, la concentrazione di proteine legate alle vescicole aumenta.
Quando questi complessi passano attraverso i raggi laser da specifici canali di fluorescenza che forniscono lunghezze d'onda appropriate, si eccitano. Queste proteine eccitate e le vescicole fosfolipidiche nel complesso emettono i rispettivi segnali di fluorescenza al momento del rilassamento allo stato fondamentale, che vengono catturati dai rivelatori appropriati.
La rilevazione di un'elevata intensità media di fluorescenza delle proteine è indicativa del legame delle proteine alle vescicole fosfolipidiche.
Iniziare gli esperimenti di legame cinetico diluendo le vescicole fosfolipidiche nel tampone di Tyrode a una concentrazione di 1 micromolare e un volume totale di 250 microlitri. Quindi, mescolare il fattore X o fX-fd marcato con fluorescenza a una concentrazione di 500 nanomolari con le vescicole fosfolipidiche in un rapporto 1:1 per ottenere un volume totale di 500 microlitri.
Iniettare immediatamente 500 microlitri della sospensione miscelata nel citometro a flusso a una velocità di flusso con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri e un filtro di emissione di 585 nanometri con una larghezza di 42 per il canale FL2.
Successivamente, misurare la fluorescenza media nel canale FL4 con eccitazione a 633 nanometri e filtro di emissione a 660 nanometri con una larghezza di 20. Quando si raggiunge la saturazione del legame, diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino al raggiungimento di una fluorescenza di base o di un plateau.