Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Il fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato, o PIP2, è un fosfolipide fosforilato minore legato alla membrana. La fosfolipasi C, o PLC, con specifici domini di legame PIP2, si lega a PIP2, generando messaggeri secondari essenziali per diversi processi cellulari.

Per rilevare le interazioni PLC-PIP2 in vitro, iniziare con una piccola vescicola unilamellare, SUV, sospensione acida, comprendente PIP2 e una miscela di fosfolipidi, una delle quali è coniugata a un colorante fluorescente sensibile al pH.

Pipettare la soluzione in un tubo di ingresso microfluidico preassemblato e collegare il tubo di uscita. Trasferire e fissare il dispositivo su un tavolino per microscopio a fluorescenza. Per gravità, i SUV passano attraverso il pavimento a microcanali, costituito da un vetrino coprioggetti idrofilo.

I SUV si adsorbono sulla superficie del vetro, il pH della soluzione riduce la repulsione elettrostatica tra i due. I SUV interagiscono con la superficie, deformandosi e fondendosi per formare grandi vescicole.

A seguito di una copertura superficiale critica, le vescicole si rompono spontaneamente, formando un doppio strato lipidico supportato, SLB. Far passare un tampone attraverso il canale, rimuovendo le vescicole non adsorbite.

Utilizzando un canale di fluorescenza adatto, è possibile visualizzare e misurare la fluorescenza del colorante sensibile al pH, altamente fluorescente a pH basso, nell'SLB.

Introdurre una soluzione PLC ricombinante nel microcanale. Il pH neutro della soluzione, al di sotto del punto isoelettrico del PLC, rende il PLC caricato positivamente.

Il PLC ricombinante, con il suo dominio di legame PIP2, si lega al PIP2, reclutando ioni idrossido caricati negativamente sulla superficie del doppio strato. Ciò rende la superficie del doppio strato più basica, spostando lo stato di protonazione del colorante e causando il quenching della fluorescenza, indicando interazioni PLC-PIP2.

Trasferire 100 microlitri di fosfatidil-4 5-bisfosfato contenente piccole vescicole unilamellari in una provetta da microcentrifuga da 0,65 millilitri. Regolare il pH della soluzione a circa 3,2 aggiungendo 6,4 microlitri di acido cloridrico 0,2 normale.

Pipettare 10 microlitri della soluzione di piccola vescicola unilamellare a pH regolato in ciascun canale attraverso l'ingresso e applicare pressione attraverso la pipetta fino a quando la soluzione non raggiunge l'uscita. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla attaccata al dispositivo. Dopo aver ripetuto questo passaggio per ciascun canale, incubare il dispositivo per 10 minuti a temperatura ambiente.

L'iniezione di vescicole nei microcanali deve essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo. Nel frattempo, tagliare i set di tubi di ingresso e uscita. Utilizzando una pinzetta, collegare il set di tubi di uscita al dispositivo, quindi fissare il dispositivo con del nastro adesivo su un tavolino da microscopio.

Immergere un'estremità del set di tubi di ingresso in 25 millilitri di tampone di corsa contenuto in un tubo conico e fissarlo con nastro adesivo per assicurarsi che il tubo sia fissato. Utilizzando un martinetto da laboratorio, posizionare il tubo conico su una superficie più alta rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microcanali tramite flusso di gravità.

Per ogni tubo di ingresso, utilizzare una siringa per aspirare 1 millilitro di tampone di scorrimento dall'estremità libera del tubo. Rimuovere il puntale della pipetta dall'ingresso e inserire l'estremità libera del tubo di ingresso nel dispositivo. Ripetere questa procedura per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo. Il fluido del buffer di scorrimento attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole non rotte in eccesso e a bilanciare il doppio strato alle condizioni sperimentali.

Quindi, aprire il software di controllo del microscopio. Nel pannello di sinistra, fai clic sulla scheda "Microscopio" e scegli l'obiettivo "10x". Fai clic su "Live", quindi sulle icone dell'immagine "Alexa 568" sulla barra degli strumenti. Utilizzando le manopole di regolazione Fine e Coarse, mettere a fuoco i microcanali. Eseguire la scansione del dispositivo per verificare la qualità degli SLB e dei canali.

Quindi, fai clic sull'icona dell'immagine "FL Shutter Closed" sulla barra degli strumenti. Fare clic sulla scheda "Acquisizione" e, in "Regolazioni di base", selezionare il tempo di esposizione. Impostare il tempo di esposizione su 200 millisecondi. Nel pannello di sinistra, fare clic su "Acquisizione multidimensionale". Nel menu "Filtri", seleziona il canale rosso. Quindi, fai clic sul menu "Time-lapse". Impostare l'intervallo di tempo su 5 minuti, la durata su 30 minuti e il menu di intervallo.

Seleziona lo strumento "Cerchio" nella scheda "Misura" e disegna un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre il cerchio è selezionato e scegliere "Proprietà". Nella scheda "Profilo", seleziona "tutto T" per visualizzare l'intensità della fluorescenza in funzione del tempo. Assicurati che questa curva raggiunga un plateau, che indica l'equilibrio, prima di procedere al passaggio successivo.

Abbassare la soluzione tampone a una distanza pari a quella del dispositivo per arrestare il flusso. Uno alla volta, staccare ciascun tubo di uscita e applicare 200 microlitri di ciascuna diluizione proteica nel canale di uscita utilizzando una pipetta. Non esercitare alcuna pressione. Lascia che la gravità faccia il lavoro. Staccare il puntale dalla pipetta e lasciarlo attaccato al dispositivo microfluidico. Ripetere questo processo per ogni canale e assicurarsi che durante questo processo non vengano introdotte bolle d'aria nei canali.

Quindi, abbassare il tubo di ingresso a terra sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a far fluire la proteina attraverso i microcanali. Fissare con nastro adesivo l'estremità libera del tubo a un contenitore per rifiuti. Far scorrere le diluizioni del dominio di omologia di Pleckstrin per 30 minuti. Nel pannello di sinistra del software, nella scheda "Time-Lapse", fare clic su "Avvia" per ricominciare l'imaging.