Cromatografia ad esclusione dimensionale con diffusione della luce multi-angolo per oligomeri proteici

Un oligomero proteico è un complesso di più subunità proteiche che si legano insieme per formare un'unità funzionale più grande.

Per determinare il peso molecolare dei monomeri proteici e dei loro oligomeri in soluzione mediante SEC-MALS, una combinazione di cromatografia ad esclusione dimensionale e diffusione della luce multi-angolo, iniziare con una cromatografia ad esclusione dimensionale, o colonna SEC.

La colonna contiene perle di gel sferiche porose simili a setacci che intrappolano al loro interno molecole di dimensioni più piccole. Equilibrare la colonna con un tampone compatibile con lo stato nativo della proteina.

Caricare un campione contenente monomeri e oligomeri proteici nella parte superiore della colonna.

Durante il flusso, gli oligomeri passano attraverso lo spazio interparticellare della colonna, mentre i monomeri rimangono intrappolati all'interno dei pori delle perle. Ciò fa sì che gli oligomeri proteici di dimensioni maggiori viaggino più velocemente rispetto ai monomeri di dimensioni più piccole.

Dirigere gli oligomeri a eluizione rapida, seguiti dai monomeri a lenta eluizione, al rivelatore MALS.

Mentre passano attraverso il rilevatore, una luce laser li illumina, che viene diffusa a diverse angolazioni. Gli oligomeri multi-subunità diffondono più luce del monomero.

L'intensità della luce diffusa a più angoli è direttamente proporzionale al peso molecolare dell'oligomero e del monomero proteico.

Iniziare questa procedura con la preparazione del sistema SEC-MALS come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando reagenti di grado HPLC, preparare un litro di soluzione salina tamponata con fosfato con 50-100 millilitri di cloruro di sodio. Filtrare il tampone a 0,1 micron utilizzando un filtro in polietere sulfone o simile.

Filtrare i primi 50-100 millilitri di tampone in un flacone di scarto per eliminare il particolato dai filtri a secco. Quindi, filtrare il resto in una bottiglia pulita e sterile, precedentemente lavata con acqua filtrata e deionizzata e conservata per evitare l'ingresso di polvere.

Lavare la colonna durante la notte a una portata di 0,5 millilitri al minuto per equilibrare la colonna nel tampone e rimuovere il particolato. Utilizzare la modalità "Flusso continuo" dell'FPLC e assicurarsi che il flusso non si interrompa fino al completamento di tutte le esecuzioni SEC-MALS. Posizionare la cella a flusso dRI in modalità di spurgo durante il lavaggio notturno.

Quando si inizia il lavaggio, aumentare gradualmente la portata per evitare l'effetto di "distacco della colonna" causato da un improvviso cambiamento di pressione nella colonna. Disattivare lo spurgo prima di iniziare le esecuzioni dei campioni.

Verificare la pulizia del sistema picchiettando leggermente il tubo a valle della colonna per rilasciare le particelle accumulate. Osservare il segnale nel rivelatore a 90 gradi sul display del pannello frontale dello strumento MALS. Verificare che il rumore picco-picco non sia superiore a 50-100 microvolt. Inoltre, verificare che l'indice di rifrazione o il segnale RI sia stabile a meno di 1 x ^10-7 unità di indice di rifrazione.

Eseguire un'iniezione "in bianco" per verificare che l'iniettore sia pulito da particelle. Un "bianco" è semplicemente il tampone di scorrimento preparato in una fiala sterile fresca. Se il picco di particelle non supera 1 millilitro di volume e non supera di 5 millivolt la linea di base, il sistema è pronto per i campioni. In caso contrario, eseguire ulteriori iniezioni in bianco fino alla pulizia o eseguire la manutenzione per pulire l'iniettore.

Ora, prepara almeno 200 microlitri di BSA a 1-2 milligrammi per millilitro nel tampone SEC. Filtrare la proteina a 0,025 micron utilizzando un filtro a punta di siringa. Scartare le prime gocce di filtrato per eliminare le particelle dai filtri a secco. In alternativa, centrifugare il campione a 10.000 volte g per 15 minuti per consentire la precipitazione di aggregati non solubili e altre particelle di grandi dimensioni. Quindi, iniettare 100 microlitri della soluzione BSA nell'ansa.