JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 7:16 min • July 8th, 2025
La calorimetria differenziale a scansione aiuta a studiare le interazioni biomolecola-ligando misurando il calore necessario per denaturare la biomolecola in assenza e presenza del ligando.
Per iniziare, prendi un riferimento contenente aptameri di DNA liberi - oligonucleotidi strutturati a singolo filamento - e un campione contenente aptameri termolabili legati al ligando. I leganti stabilizzano la struttura secondaria dell'aptamero.
Eseguire una scansione in avanti riscaldando le soluzioni. Al raggiungimento della temperatura di fusione, gli aptameri liberi si denaturano.
Gli aptameri stabilizzati con ligando si dissociano dai leganti e si denaturano a una temperatura relativamente più alta, causando un aumento della temperatura di fusione rispetto agli aptameri liberi. Ad alte temperature, un sottogruppo di ligandi ottiene una forma secondaria irreversibile con una bassa affinità di legame.
Successivamente, eseguire una scansione inversa raffreddando le soluzioni per riguadagnare la struttura dell'aptamero. Alla temperatura più bassa, i leganti iniziali e convertiti nel campione si legano agli aptameri.
Durante la seconda scansione in avanti, gli aptameri legati con una debole affinità ai ligandi convertiti si dissociano e si denaturano a una temperatura inferiore rispetto agli aptameri iniziali legati al ligando, causando un abbassamento della temperatura di fusione.
Con scansioni successive, i ligandi continuano a convertirsi nella forma secondaria, con conseguente completo esaurimento della forma iniziale. Procurati il termogramma.
Ad ogni scansione, la temperatura di fusione dell'aptamero legato al ligando si sposta verso l'aptamero libero, indicando la debole affinità di legame della forma secondaria.
Degassare le soluzioni di tampone, biomolecola e ligando in un degasatore da tavolo prima di caricarle nel calorimetro a scansione differenziale o DSC. Svitare la maniglia a pressione dal DSC. Quindi, far passare il tubo in silicone dal tampone di lavoro e fissarlo alla flangia anteriore del capillare di riferimento.
Creare un ponte tra i capillari di riferimento e quelli del campione collegando la flangia di riferimento posteriore alla flangia anteriore del campione. Quindi, collegare un pezzo di tubo in silicone alla flangia posteriore del campione che corre verso un pallone di scarico con una linea del vuoto collegata. Accendere la linea del vuoto per lavare il DSC con 200 millilitri di tampone di lavoro.
Inizia collegando sezioni di circa 3-5 centimetri di tubo in silicone alle flange capillari di riferimento. Quindi, inserire un puntale per pipetta da 1 millilitro nel tubo in silicone della flangia posteriore. Aspirare 0,8 millilitri di tampone di lavoro con una pipetta e inserire il puntale della pipetta con tampone nel tubo in silicone della flangia di riferimento anteriore.
Premere delicatamente lo stantuffo della pipetta verso il basso per far passare il tampone di lavoro attraverso il tubo di silicone anteriore nel capillare di riferimento e verso l'alto nella punta della pipetta collegata della flangia posteriore. Premere lo stantuffo della pipetta verso il basso fino a quando il livello del tampone di lavoro non raggiunge appena sopra il tubo in silicone anteriore. Quindi, rilasciare lo stantuffo della pipetta fino a quando il livello del tampone di lavoro non raggiunge appena sopra il tubo in silicone posteriore. Continuare a far passare il tampone di lavoro avanti e indietro nel capillare di riferimento per eliminare il volume delle bolle.
Quindi, tappare il puntale posteriore della pipetta con un indice e tirare delicatamente verso l'alto il puntale posteriore della pipetta e la pipetta anteriore per rimuoverli dalle flange di riferimento con il tubo in silicone collegato. Caricare il capillare del campione con il tampone di lavoro come prima.
Posizionare un tappo di plastica nera sulle flange posteriori di riferimento e campione, lasciando scoperte le flange anteriori. Collegare l'impugnatura a pressione al DSC, quindi aprire il software DSC e pressurizzare lo strumento facendo clic sulla freccia rossa "Su" nella parte superiore dell'interfaccia una volta che la lettura della potenza si è stabilizzata. La potenza del DSC è indicata in una casella in alto a destra dell'interfaccia, insieme alla lettura della temperatura e della pressione dello strumento.
Equilibrare il DSC con il buffer di lavoro eseguendo una scansione diretta e inversa. Nella scheda "Metodo sperimentale" sul lato sinistro dello schermo, assicurarsi che l'opzione "Scansione" sia selezionata per eseguire il DSC in modalità di scansione della temperatura.
Nel riquadro "Parametri di temperatura" nella scheda "Metodo sperimentale", fare clic sul pulsante per il riscaldamento. Inserire 1 e 100 gradi Celsius per le temperature sperimentali inferiore e superiore, 1 grado Celsius al minuto per la velocità di scansione e 60 secondi per il periodo di equilibrio. Fare clic sul pulsante "Aggiungi serie" sotto il campo di immissione per il periodo di equilibratura. Inserisci 2 nel campo "Passaggi per l'aggiunta" nella finestra pop-up e seleziona la casella "Riscaldamento/Raffreddamento alternato". Fare clic su "OK".
Le scansioni aggiunte vengono visualizzate nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ogni scansione siano quelli desiderati. Inizia l'esperimento facendo clic sul pulsante verde "Riproduci" nella parte superiore dell'interfaccia. Passare alla finestra desiderata e immettere un nome file per salvare l'esperimento nella finestra popup. Per visualizzare l'avanzamento dell'esperimento, fai clic sulla scheda "Dati" a destra della scheda "Metodo dell'esperimento".
Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione di base dei dati del campione ricaricando il DSC con il tampone di lavoro in entrambi i capillari. Raccogli più scansioni in avanti e indietro in un intervallo di temperatura adeguato a 1 grado Celsius al minuto con un tempo di equilibratura superiore di 120 secondi.
Eliminare le precedenti scansioni di bilanciamento del buffer dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziandole singolarmente e facendo clic sulla "X" rossa al centro a destra dell'interfaccia.
Aggiungi le nuove scansioni facendo clic sul pulsante "Aggiungi serie", inserendo 20 nel campo "Passaggi da aggiungere" e selezionando la casella "Riscaldamento/Raffreddamento alternativo". Quindi, fai clic su "OK" ed esegui l'esperimento facendo clic sul pulsante verde "Riproduci" come prima.
Ripetere questi passaggi con un tampone di lavoro contenente la concentrazione desiderata di ligando in entrambi i capillari per ottenere gli esperimenti di riferimento per il ligando. Raccogli due esperimenti separati da utilizzare per acquisire la costante di velocità per la conversione del ligando termolabile.
Per il set di dati della biomolecola gratuito, assicurarsi che il capillare di riferimento contenga il tampone di lavoro, mentre il capillare del campione contenga la biomolecola libera alla concentrazione desiderata nel tampone di lavoro. Successivamente, eseguire gli esperimenti di esempio utilizzando la stessa procedura di caricamento DSC e i parametri sperimentali utilizzati nelle scansioni di riferimento.
Per gli esperimenti legati al ligando, assicurarsi che il ligando si trovi nel tampone di lavoro nel capillare di riferimento e che la biomolecola più il ligando si trovino nel tampone di lavoro nel capillare del campione. Lavare il sistema tra le aggiunte di diversi leganti come prima.
Eseguire un ulteriore esperimento con la biomolecola legata al ligando termolabile in cui il periodo di equilibrio ad alta temperatura viene aumentato a 600 secondi e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi di prima. Procedere all'elaborazione e all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.