Saggio di legame competitivo per identificare i composti che interrompono le interazioni recettore-ligando

Il saggio di legame competitivo identifica piccole molecole che interrompono le interazioni recettore-ligando legandosi in modo competitivo a un recettore bersaglio, inibendo il legame naturale del ligando.

Per identificare le interazioni di un recettore con il suo ligando naturale in presenza di un antagonista di una piccola molecola specifico del recettore, iniziare con una sospensione di cellule di linfociti T umani che esprimono il recettore bersaglio.

Aggiungere la sospensione cellulare ai pozzetti di una piastra multipozzetto contenente concentrazioni crescenti di antagonisti. Incubare. L'antagonista si lega al sito di legame ortosterico, il sito naturale di legame del ligando del recettore.

Aggiungere ai pozzetti una concentrazione fissa di ligandi naturali marcati in fluorescenza. Incubare.

A basse concentrazioni, gli antagonisti occupano pochi siti di legame ortosterici, consentendo il legame naturale del ligando ai recettori. Tuttavia, a concentrazioni più elevate, gli antagonisti occupano la maggior parte dei siti di legame ortosterici, consentendo un legame minimo ligando-recettore naturale.

Centrifuga per pellettare le cellule. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in paraformaldeide per fissarle, preservando la morfologia cellulare.

Utilizzando un citometro a flusso, analizzare i segnali di fluorescenza dei singoli linfociti T che esprimono i recettori legati agli antagonisti e ai ligandi fluorescenti.

Una diminuzione dose-dipendente dell'intensità media della fluorescenza con l'aumentare delle concentrazioni di antagonisti recettore-specifico indica un legame competitivo degli antagonisti ai siti di legame del recettore ortosterico, inibendo l'interazione ligando-recettore naturale.

Per iniziare, erogare 100 microlitri di soluzione composta in una piastra trasparente a fondo tondo a 96 pozzetti secondo un layout sperimentale predefinito.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare da un serbatoio di reagenti alla piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.

Dopo l'incubazione, aggiungere 50 microlitri di CXCL12 marcato in fluorescenza da 100 nanogrammi per millilitro da un serbatoio di reagenti simile ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.

Quindi, centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 400 volte la gravità per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate capovolgendo la piastra. Asciugare la piastra su un fazzoletto. Aggiungere 200 microlitri di tampone di saggio fresco da un serbatoio di reagenti ai pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.

Procedere immediatamente alla centrifugazione della piastra per 5 minuti a 400 volte la gravità a temperatura ambiente. Anche in questo caso, rimuovere il surnatante capovolgendo la piastra e asciugandola su un fazzoletto. Infine, risospendere delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di paraformaldeide all'1% disciolta in PBS. Questo passaggio riparerà le celle.

Per analizzare i campioni mediante citometria a flusso, avviare il dispositivo e aprire il software corrispondente. Selezionare i parametri cellulari da visualizzare in un formato dot-blot come l'area di diffusione diretta, l'area di diffusione laterale e, in una vista a istogramma, il canale di rilevamento del fluoroforo.

Scegliere un campione, ad esempio un campione di controllo negativo, per eseguire il gating di una popolazione cellulare omogenea definita in base ai parametri di dispersione diretta e laterale. Adattare le impostazioni per il caricamento delle cellule nel dispositivo di citometria a flusso.

Selezionare tre miscele prima dell'iniezione. Selezionare l'iniezione automatica di 100 microlitri di cellule fissate e utilizzare una portata del campione di 1,5 microlitri al secondo. Eseguire l'esempio selezionando "Acquisisci dati". I parametri di dispersione diretta e laterale per questo campione, nonché il rilevamento del fluoroforo, appariranno ora sullo schermo.

Ora seleziona lo strumento di gating del software. Sulla base della visualizzazione del grafico a punti a dispersione diretta e laterale a dispersione, è possibile predefinire una popolazione cellulare omogenea e vitale mediante gating. Selezionare questa opzione per analizzare 20.000 "eventi" per campione.

Ciò significa che per ogni campione verranno analizzate 20.000 cellule che rientrano in un gate predefinito. L'acquisizione dei dati continuerà fino al raggiungimento di questo numero di eventi.

Iniziare la corsa selezionando prima i pozzetti da analizzare. Quindi, seleziona "Esegui Wells".

Il dispositivo di citometria a flusso analizzerà ora questi campioni uno per uno registrando l'intensità media della fluorescenza per ciascun campione, che corrisponde al segnale fluorescente medio delle 20.000 cellule che rientrano nel gate predefinito.

Infine, eseguire l'analisi dei dati come descritto nel protocollo.