Saggio reporter basato su ELISA per studiare l'interazione recettore-ligando nelle cellule BW

Per studiare le interazioni recettore-ligando, iniziare con una piastra multipozzetto contenente terreni con cellule bersaglio che esprimono ligandi di prova sulla loro superficie.

Aggiungi cellule BW di topo ingegnerizzate, una nuova popolazione di cellule B che esprime recettori chimerici legati alla membrana. I recettori chimerici comprendono il dominio extracellulare di un recettore specifico fuso con il dominio di segnalazione transmembrana e intracellulare del recettore delle cellule B.

I ligandi sulle cellule bersaglio interagiscono con il dominio extracellulare dei recettori chimerici delle cellule BW, causando l'attivazione del dominio di segnalazione intracellulare nelle cellule BW. Ciò innesca la segnalazione a valle e la produzione di citochine, molecole reporter secretorie che vengono rilasciate al di fuori delle cellule BW, che appaiono nei media.

Centrifugare la piastra. Trasferire il surnatante contenente citochine in una piastra ELISA pre-rivestita con anticorpi anti-citochine. Le citochine interagiscono con le regioni Fab degli anticorpi, portando alla loro immobilizzazione sulla superficie della placca.

Trattare la piastra con una soluzione bloccante per bloccare i siti di legame non specifici. Aggiungere anticorpi anti-citochine biotinilati, che interagiscono con le citochine pre-legate e formano complessi immunitari.

Sovrapporre la piastra con una soluzione di streptavidina coniugata con enzima. La streptavidina si lega con la biotina sui complessi immunitari.

Trattare la piastra con un substrato. L'interazione enzima-substrato produce un prodotto colorato, conferendo lo stesso colore alla soluzione. La soluzione colorata conferma la presenza di molecole reporter, indicando una riuscita interazione recettore-ligando.

Utilizza 50.000 cellule BW trasfettate con i target desiderati in un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra per 48 ore. Quindi, congelare la piastra a -20 gradi Celsius.

Rivestire una piastra ELISA con anticorpo anti-Mouse IL-2. Mettere lo 0,05% di microgrammi di anti-topo-IL-2 in un volume di 50 microlitri di PBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra rivestita per una notte a 4 gradi Celsius.

Utilizzare un breve periodo di incubazione a 37 gradi Celsius per scongelare le cellule BW congelate che sono state precedentemente incubate con i loro bersagli. Quindi, centrifugare la piastra e trasferire 100 microlitri di surnatante da ciascun pozzetto alla piastra ELISA pre-rivestita e incubare a 37 gradi Celsius per 2 ore.

Successivamente, aggiungere la biotina anti-topo-IL-2 alla piastra ELISA. Quindi, dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere alla piastra la streptavidina coniugata con HRP. Dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato TMB a ciascun pozzetto della piastra ELISA. Infine, leggere la lastra ELISA a 650 nanometri.