JoVE Encyclopedia of Experiments
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:05 min • July 8th, 2025
Le proteine leganti i nucleotidi della guanina – una categoria di GTPasi – funzionano come un interruttore molecolare, alternando una forma attiva legata al GTP e una forma inattiva legata al GDP.
Le GTPasi attive si legano a specifici partner proteici. Questi partner competono per lo stesso sito di legame sulle GTPasi.
Per studiare il legame competitivo, inizia prendendo una sospensione di GTPasi legata al GTP immobilizzata su perline magnetiche. Aggiungere il primo partner di interazione: la proteina A marcata in fluorescenza. Incubare sotto agitazione per mantenere le perle in sospensione. La proteina A lega e satura i siti di legame su tutte le molecole di GTPasi.
Suddividere equamente questa soluzione in più tubi. Aggiungere un secondo partner di interazione, la proteina B marcata in fluorescenza, alle provette in quantità crescenti. Incubare sotto agitazione.
La proteina B si lega allo stesso sito di legame sulle GTPasi, sostituendo competitivamente la proteina A.
Esporre i tubi a un campo magnetico per raccogliere le perline su un lato. Scartare il surnatante per rimuovere le proteine non legate. Risospendere le perle complessate con le proteine in un tampone adatto e quantificare le proteine legate.
Tracciare le intensità relative delle proteine A e B legate alla GTPasi ad ogni concentrazione di proteina B.
La proteina B raggiunge un equilibrio - occupando i siti di legame di metà delle molecole di GTPasi - a una concentrazione relativamente inferiore rispetto alla proteina A, indicando la maggiore affinità della proteina B per la GTPasi.
Per eseguire la rilegatura da competizione, predisporre sei provette per microfuge contenenti ciascuna 200 microlitri di tampone per la rilegatura da competizione. Ogni provetta dovrebbe contenere anche 10 microlitri di perle Rac1 caricate con nucleotidi e cinque microlitri di proteina legante Rac1 A come proteina a legame costante.
A ciascuna provetta, aggiungere 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 microlitri di proteina B legante Rac1 come proteina legante variabile. Questi volumi assumono concentrazioni di stock approssimativamente uguali delle proteine leganti costanti e variabili e potrebbe essere necessario aggiustarli.
Portare il volume totale della miscela legante a 235 microlitri con l'aggiunta del tampone legante da competizione. Successivamente, installa una provetta per microfugi contenente 200 microlitri di tampone da competizione, 10 microlitri di perle Rac1 caricate con nucleotidi sperimentali e 10 microlitri di proteina A legante Rac1.
Quindi, impostare le provette di controllo GDP, GTPγS e no nucleotide come descritto nel protocollo di testo. Incubare le provette per due ore, mescolando per inversione a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le perle tre volte con il tampone legante da competizione.
Infine, eluire le proteine legate in 20 microlitri di tampone riducente del campione.