JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 4:05 min. • July 8th, 2025
Le proteine leganti i nucleotidi della guanina – una categoria di GTPasi – funzionano come un interruttore molecolare, alternando una forma attiva legata al GTP e una forma inattiva legata al GDP.
Le GTPasi attive si legano a specifici partner proteici. Questi partner competono per lo stesso sito di legame sulle GTPasi.
Per studiare il legame competitivo, inizia prendendo una sospensione di GTPasi legata al GTP immobilizzata su perline magnetiche. Aggiungere il primo partner di interazione: la proteina A marcata in fluorescenza. Incubare sotto agitazione per mantenere le perle in sospensione. La proteina A lega e satura i siti di legame su tutte le molecole di GTPasi.
Suddividere equamente questa soluzione in più tubi. Aggiungere un secondo partner di interazione, la proteina B marcata in fluorescenza, alle provette in quantità crescenti. Incubare sotto agitazione.
La proteina B si lega allo stesso sito di legame sulle GTPasi, sostituendo competitivamente la proteina A.
Esporre i tubi a un campo magnetico per raccogliere le perline su un lato. Scartare il surnatante per rimuovere le proteine non legate. Risospendere le perle complessate con le proteine in un tampone adatto e quanti
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