Saggio su microarray di antigeni virali per rilevare gli isotipi di anticorpi nel siero contro l'antigene virale

Iniziare il test di microarray dell'antigene virale con un vetrino di microarray dell'antigene virale preparato.

Il vetrino contiene più pad, ciascuno con un singolo array contenente centinaia di antigeni purificati di più ceppi virali stampati su punti disposti in una griglia. Ogni punto contiene un singolo tipo di antigene adsorbito sulla superficie tridimensionale della nitrocellulosa microporosa.

Fissare il vetrino in una camera per facilitarne la manipolazione durante le fasi successive. Aggiungere un tampone bloccante contenente proteine che si legano alle superfici rimanenti del vetrino per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla superficie.

Incubare il vetrino per microarray con siero umano diluito. Gli isotipi anticorpali nel siero, specifici per gli antigeni presenti sul vetrino, riconoscono e si legano agli epitopi degli antigeni.

Rimuovere il siero. Lavare con un tampone per rimuovere gli anticorpi e le proteine non legati sul vetrino.

Aggiungere miscele di anticorpi secondari coniugati con punti quantici, ciascuna con un punto quantico diverso. Gli anticorpi secondari isotipo-specifici si legano in modo specifico al rispettivo isotipo di anticorpo sierico legato agli antigeni sul vetrino.

Utilizzare un imager per microarray per quantificare il legame degli anticorpi agli antigeni all'interno del vetrino del microarray.

Dopo l'eccitazione a lunghezze d'onda appropriate, i punti quantici legati agli anticorpi secondari ritornano allo stato fondamentale ed emettono specifici segnali fluorescenti che vengono rilevati dal fotorivelatore.

L'intensità della fluorescenza spot quantifica l'isotipo sierico dell'anticorpo all'interno del siero legato al singolo antigene.

Dopo aver programmato il software di stampa con il protocollo desiderato, avviare la tiratura. Al termine, posizionare i vetrini per microarray non sondati in una scatola a prova di luce in una cabina essiccante a temperatura ambiente.

Per sondare i sieri alla ricerca di anticorpi sul microarray, utilizzare le clip per fissare i vetrini del microarray con il pad rivolto verso l'alto sulle camere di sondaggio e posizionare le camere nei telai.

Fare attenzione durante il montaggio dei vetrini, poiché si rompono facilmente, e verificare la presenza di eventuali perdite dopo la reidratazione. Se necessario, smontare e rimontare le guide per riparare le perdite.

Reidratare i vetrini con 100 microlitri di tampone bloccante filtrato per pozzetto e diluire i sieri in un rapporto da 1 a 100 in 100 microlitri di tampone bloccante per campione. Quindi, incubare i vetrini di microarray reidratati e i sieri diluiti per 30 minuti a temperatura ambiente e da 100 a 250 rotazioni al minuto su un agitatore orbitale.

Al termine dell'incubazione, utilizzare i puntali delle pipette collegati a una linea del vuoto con un pallone di raccolta secondario per aspirare con cura il tampone di blocco dall'angolo di ciascuna camera senza toccare i tamponi e aggiungere immediatamente i sieri diluiti ai tamponi senza lasciare asciugare i tamponi. Quindi, posizionare i telai coperti in vassoi contenenti tovaglioli di carta umidi sigillati per mantenere l'umidità e incubare i telai durante la notte a 4 gradi Celsius su uno shaker a dondolo.

Per la marcatura degli anticorpi secondari coniugati con punti quantici, aspirare accuratamente i sieri, come appena dimostrato, e sciacquare i vetrini con tre lavaggi in 100 microlitri di tampone T-TBS fresco per pozzetto per 5 minuti ciascuno su un agitatore orbitale. I vetrini vengono quindi incubati con una miscela di anticorpi secondari coniugati con punti quantici e quindi lavati tre volte come descritto nel protocollo utilizzando la stessa tecnica appena dimostrata.

Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere con cura i vetrini dalle camere e sciacquare delicatamente i vetrini con acqua filtrata a doppia distillazione, quindi posizionare ogni vetrino in un tubo da 50 millilitri. Quindi, asciugare i vetrini mediante centrifugazione.

Per acquisire le immagini dei vetrini del microarray, accendere prima l'imager portatile e posizionare con cura il vetrino da riprendere rivolto verso il basso nel supporto del vetrino nella camera di imaging. Aprire il software di imaging e, nella scheda "Configura termocamera", selezionare la configurazione del vetrino appropriata.

Nella scheda "Controllo immagine", selezionare il canale fluorescente appropriato e regolare i tempi di esposizione e di acquisizione, a seconda della reattività del sera. Quindi, fai clic su "Acquisisci" per avviare l'acquisizione dell'immagine. Al termine dell'acquisizione, utilizzare le griglie orientate sui fiducial marker per rilevare gli spot dell'array.