Isolamento dei macrofagi dal ganglio della radice dorsale del topo mediante dissociazione meccanica

Il ganglio della radice dorsale, o DRG, è un gruppo di corpi cellulari neuronali lungo il midollo spinale che trasportano le informazioni sensoriali dal sistema nervoso periferico a quello centrale. La lesione dei nervi periferici provoca l'accumulo di macrofagi nel DRG e lo sviluppo di dolore neuropatico.

Per isolare i macrofagi vitali utilizzando un metodo privo di enzimi, prelevare il tessuto DRG di topo appena sezionato in un omogeneizzatore riempito con tampone ghiacciato per limitare lo stress cellulare. Usando un pestello, omogeneizzare meccanicamente il tessuto per rilasciare le cellule.

Filtrare attraverso un filtro cellulare per rimuovere i grumi cellulari e ottenere una sospensione a cellula singola nel flusso. L'omogeneizzato tissutale contiene neuroni e cellule non neuronali, che includono macrofagi e mielina fluttuante, la guaina isolante dei neuroni.

Aggiungere l'omogeneizzato filtrato in una provetta contenente un mezzo di gradiente di densità e centrifugare. Sotto la forza centrifuga, le cellule vitali con una maggiore densità di galleggiamento si depositano sul fondo del tubo per formare un pellet, mentre la mielina rimane sospesa. Scartare il surnatante.

Risospendere le cellule in un tampone contenente anticorpi coniugati con fluorofori contro i recettori della superficie cellulare specifici dei macrofagi. Incubare per la durata richiesta. L'anticorpo si lega al suo recettore sulle cellule macrofagiche, marcando così in modo fluorescente la superficie cellulare. Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.

Analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso. Un segnale di fluorescenza anticorpo-specifico indica la presenza di macrofagi nel campione.

Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del mezzo a gradiente di densità mescolando nove volumi del mezzo con un volume di 10X HBSS privo di calcio e magnesio e tenerlo in ghiaccio. Verificare che il topo sia completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta al pizzicamento della zampa posteriore.

Inizia posizionando un topo anestetizzato all'interno di una cappa chimica in posizione supina con quattro zampe fissate con del nastro adesivo. Usa una pinza per sollevare la pelle sotto la gabbia toracica, quindi con le forbici chirurgiche, fai una piccola incisione per esporre il fegato e il diaframma. Usando le stesse forbici, tagliare il diaframma e la gabbia toracica, quindi aprire la cavità pleurica per esporre il cuore pulsante.

Successivamente, con le forbici dell'iride, taglia rapidamente l'appendice atriale destra. Una volta notato il sanguinamento, inserire un ago calibro 30 nell'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare lentamente 10 millilitri di PBS 1X pre-raffreddato per perfondere l'animale.

Per eseguire la laminectomia dorsale, posizionare il mouse in posizione prona. Usa un bisturi misura 11 per praticare due incisioni longitudinali laterali profonde partendo dalla regione toracica fino alla regione sacrale. Quindi, rimuovere la pelle esponendo lo strato muscolare dorsale. Quindi, con Friedman-Pearson Rongeur, staccare i tessuti connettivi e i muscoli fino a quando i processi della colonna lombosacrale e i processi trasversali bilaterali sono esposti.

Innanzitutto, usa un Rongeur di Friedman-Pearson per aprire con cautela la colonna vertebrale dorsale. Quindi, passa da un Rongeur Friedman-Pearson a una Forbice a molla Noyes per rimuovere le ossa vertebrali, esponendo il midollo spinale con i nervi spinali intatti attaccati. Sezionare con cura il DRG lombare omolaterale e controlaterale.

Mettilo in 1 millilitro di calcio ghiacciato e 1X HBSS senza magnesio in un omogeneizzatore tissutale Dounce. Omogeneizzare il tessuto DRG nell'omogeneizzatore Dounce con un pestello sciolto per 20-25 volte. Posizionare un colino cellulare sterile in nylon da 70 micrometri in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Utilizzare 800 microlitri di 1X HBSS ghiacciato per bagnare il filtro cellulare.

Utilizzare una pipetta per raccogliere la sospensione di tessuto omogeneizzato dall'omogeneizzatore sul filtro a cellule umide e raccoglierla nella provetta conica da 50 millilitri. Sciacquare due volte l'omogeneizzatore con 800 microlitri di 1X HBSS ghiacciato, raccogliendo il liquido nello stesso tubo conico da 50 millilitri per aumentare la resa.

Aggiungere 1,5 millilitri di terreno di gradiente di densità isotonico ghiacciato bilanciato in una provetta sterile di polistirene FACS da 5 millilitri. Trasferire l'omogeneizzato di cellule dalla provetta conica da 50 millilitri in questa provetta FACS e pipettare su e giù per mescolare bene.

Aggiungi altri 500 microlitri di 1X HBSS per sigillare la parte superiore. Centrifugare le celle a 800 volte g per 20 minuti a 4 gradi Celsius. Aspirare con cura il surnatante contenente mielina nel terreno, senza disturbare il pellet cellulare sul fondo della provetta.

Aggiungere 100 microlitri di PBS contenente il 5% di siero fetale bovino al pellet e risospendere le cellule DRG. Quindi, aggiungere l'anticorpo CX3CR1-APC del topo alfa alle cellule e incubare al buio a 4 gradi Celsius per 1 ora.

Lavare le celle una volta con 5 millilitri di PBS. Centrifugare le celle a 360 volte g per 8 minuti a 4 gradi Celsius. Aspirare il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in 300 microlitri di PBS per l'analisi FACS.