Isolamento dei linfociti da un cerotto di Peyer di topo

I cerotti di Peyer, PP, aggregati di tessuti linfoidi organizzati nella parete dell'intestino tenue, contengono cellule immunitarie tra cui linfociti B, linfociti T, cellule dendritiche e macrofagi.

Per isolare i linfociti dai PP di topo, iniziare con un topo soppresso. Incidere la parete addominale, esponendo la cavità peritoneale. Individua il cieco. Sezionare la giunzione ileocecale per separare il cieco dall'intestino tenue.

Asportare il mesentere e incidere l'intestino tenue in corrispondenza del duodeno per rimuovere l'intestino tenue dalla cavità peritoneale. Mettere l'intestino tenue in un piatto a più pozzetti contenente terreno refrigerato e risciacquare per rimuovere i detriti.

Posizionare l'intestino tenue con il lato mesenterico rivolto verso il basso e inumidire con un mezzo per mantenere l'idratazione dei tessuti. Identificare i PP, aggregati bianchi multilobulati sul lato anti-mesenterico della parete intestinale.

Asportare con cura i PP, escludendo il tessuto intestinale circostante. Trasferire in un tubo contenente il mezzo. Incubare sotto costante agitazione. Questa fase di agitazione stacca il muco, i detriti cellulari e qualsiasi materia fecale dai PP, migliorando così il recupero dei linfociti PP.

Quindi, trasferire il tessuto in un colino cellulare con una dimensione della maglia appropriata. Distruggi delicatamente i PP e rilascia le cellule. Sciacquare con il terreno attraverso il colino per ottenere una sospensione di linfociti unicellulari. Centrifugare la sospensione a bassa temperatura per mantenere la stabilità della cella.

Risospendere i linfociti in terreno e utilizzarli per ulteriori analisi.

Inizia mettendo un topo in posizione supina e sterilizzando l'addome con etanolo al 70%. Praticare un'incisione addominale sulla linea mediana attraverso la pelle e il peritoneo dal pube alla gabbia toracica per aprire la cavità peritoneale e localizzare il cieco e la giunzione ileocecale.

Effettuare un taglio il più distale possibile, all'incrocio per separare l'intestino tenue dal cieco, e tagliare il mesentere con le forbici per asportare con cura tutto l'intestino tenue fino allo sfintere pilorico.

Tagliare la giunzione tra il piloro e il duodeno per staccare completamente l'intestino tenue dalla cavità addominale e posizionare l'intestino tenue isolato in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente terreno RPMI freddo, integrato con siero fetale bovino al 10% o FBS su ghiaccio. Quindi, agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti sono immersi nel mezzo freddo.

Quando tutti gli intestini sono stati prelevati, usa una pinza per afferrare il grasso mesenterico di un bordo dell'intestino e posiziona il campione, con il lato mesenterico rivolto verso il basso, su un tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con RPMI più il 10% di FBS per evitare la disidratazione e la viscosità dei tessuti e individuare le chiazze di Peyer, che appaiono come aggregati multilobulati bianchi con una forma simile a un cavolfiore sul lato anti-mesenterico della parete intestinale.

Per raccogliere i cerotti di Peyer, utilizzare forbici chirurgiche curve con la curva rivolta verso l'alto per asportare delicatamente ogni cerotto dai suoi bordi distali e prossimali, facendo attenzione a escludere il tessuto intestinale circostante, e posizionare i cerotti di Peyer in pozzetti individuali di una piastra a 12 pozzetti contenente RPMI ghiacciato più il 10% di FBS, mentre vengono raccolti.

Quando tutti i cerotti sono stati acquisiti, utilizzare le forbici per tagliare la punta di una micropipetta da 1 millilitro in modo che il diametro sia sufficientemente grande per aspirare i singoli cerotti di Peyer e trasferire i cerotti di Peyer in una provetta conica da 150 millilitri per topo, contenente 25 millilitri di RPMI a 37 gradi Celsius più il 10% di FBS.

Quindi, posizionare i tubi in un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius con agitazione continua a 125-150 giri/min per 10 minuti. Al termine dell'agitazione, trasferire i cerotti di Peyer su un colino cellulare da 140 micrometri per topo e utilizzare l'estremità in gomma dello stantuffo della siringa da 110 millilitri per animale per interrompere delicatamente i cerotti di Peyer attraverso la rete in singoli tubi conici da 50 millilitri.

Sciacquare i filtri con 15-20 millilitri di RPMI freddo più il 10% di FBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver scartato con cura il surnatante, risospendere le cellule a circa 1 x 10⁷ cellule per millilitro di RPMI più il 10% di concentrazione di FBS per il conteggio. Quindi, trasferire da 2 a 2,5 x 10⁶ celle per 200 micro-litri di terreno, in ciascun pozzetto di una piastra di fondo rotonda da 96 pozzetti, e pellettare le celle mediante centrifugazione.