Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da Buffy Coats umani

Le cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, sono costituite da una popolazione eterogenea di cellule immunitarie specializzate, tra cui linfociti, monociti e cellule dendritiche.

Per isolare le PBMC, inizia con una provetta contenente un buffy coat umano appena ottenuto sangue. Il sangue del buffy coat contiene PBMC, insieme a granulociti con nuclei multilobati, eritrociti e piastrine sospesi nel plasma.

Sovrapporre con cura la sospensione buffy coat su un volume uguale di un mezzo di gradiente di densità con una densità specifica desiderata ottimale per la separazione di PBMC.

Durante la centrifugazione, i diversi tipi di cellule si separano in strati distinti, in base alla densità delle cellule rispetto al mezzo di gradiente. Inoltre, i polisaccaridi nel mezzo del gradiente di densità promuovono l'aggregazione e la sedimentazione degli eritrociti.

Gli eritrociti e i granulociti con densità più elevate sedimentano sul fondo della tuba, mentre il plasma, con la densità più bassa, forma lo strato più superficiale. Le PBMC, che hanno densità inferiori rispetto al mezzo del gradiente di densità, formano uno strato bianco torbido all'interfaccia del mezzo del gradiente plasma-densità.

Rimuovere lo strato superiore di plasma. Raccogliere con cura lo strato torbido contenente le PBMC e trasferirlo in una provetta fresca con terreno privo di siero. Centrifugare per pellettare i PBMC. Scartare il surnatante contenente piastrine e il mezzo di gradiente residuo.

Risospendere le PBMC in un terreno fresco e utilizzarle per ulteriori analisi.

Per isolare la PBMC dai buffy coat di donatori umani, utilizzare una pipetta per sovrapporre lentamente 15 millimetri di sangue di buffy coat, lungo il lato di una provetta da 50 millilitri, su 15 millilitri di terreno a gradiente di densità, e separare le cellule mediante centrifugazione. Utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere lo strato superiore di plasma e trasferire con cura lo strato di cellule mononucleate in una nuova provetta da 50 millilitri.

Aggiungere il terreno RPMI senza siero alle cellule fino a un volume finale di 50 millilitri e capovolgere delicatamente la provetta alcune volte prima di centrifugare. Quindi, risospendere le cellule in 20 millilitri di terreno privo di siero per il conteggio.