JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:47 min • July 8th, 2025
Per suscitare una risposta immunitaria, le cellule dendritiche, DC, presentano un antigene mostrato con MHC di classe II e le molecole co-stimolatorie CD80 e CD86. In base alle caratteristiche della risposta immunitaria, si suddividono in DC immature, mature e tollerogene.
Per generare vari sottogruppi di cellule dendritiche in vitro, iniziare con una piastra multi-pozzetto contenente monociti umani - cellule precursori immunitarie in un mezzo completo contenente fattori di crescita e la citochina IL-4 - una molecola di segnalazione.
Incubare le cellule per un periodo prolungato. I fattori di crescita e l'IL-4 inducono la proliferazione e la differenziazione dei monociti in DC immature.
Le DC immature possiedono recettori per il riconoscimento dei pattern, PRR, ed esprimono molecole MHC basse di classe II e co-stimolatorie, esibendo una ridotta capacità di suscitare una risposta immunitaria.
Trattare un pozzetto contenente DC immature con agenti immunomodulatori: vitamina D3 e glucocorticoidi. Questi agenti immunomodulatori sottoregolano l'espressione delle molecole MHC di classe II e co-stimolatorie. Ciò porta alla differenziazione in DC tollerogeniche, cellule immunoregolatorie che impediscono risposte immunitarie esagerate o indesiderabili.
Trattare un altro pozzetto contenente DC immature con lipopolisaccaride, LPS, un antigene. L'LPS interagisce con il recettore toll-like 4 delle cellule, un PRR, avvia una cascata di segnalazione e le differenzia in cellule mature. Queste cellule esprimono molecole co-stimolatorie di classe II MHC e PRR, efficienti per l'elaborazione e la presentazione dell'antigene.
Osservare i pozzetti trattati in modo differenziato per le caratteristiche morfologiche distinte che rappresentano i sottotipi di cellule dendritiche.
Seminare quattro serie di monociti CD14+ in una concentrazione compresa tra 0,3 e 0,5 x 106 per millilitro di terreno di coltura cellulare di IL-4 in piastre a sei pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Il giorno 4, rimuovere 850 microlitri di terreno dalla coltura e centrifugare.
Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare. Aggiungere nuovamente la miscela di cellule alla coltura. Il giorno 5, aggiungere 1 microlitro di brodo di vitamina D3 e 1 microlitro di brodo di desametasone per millilitro di terreno a due dei set per generare moDC tollerogenici.
Il giorno 6, aggiungere 200 nanogrammi per millilitro di GM-CSF e 200 nanogrammi per millilitro di IL-4 a tutti i set. Aggiungere 1 microgrammo per millilitro di LPS a uno dei set trattati solo con GM-CSF e IL-4 per generare moDC maturi.
Aggiungere 1 microgrammo per millilitro di LPS a un set di moDC in modalità tollerogenica per generare moDC LPS-tolerogenici. Infine, il giorno 7, raccogliere i diversi tipi di moDC lavando la piastra di coltura con PBS-EDTA.