JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:58 min. • July 8th, 2025
Per eseguire la separazione immunomagnetica negativa delle cellule B, raccogliere il sangue periferico umano in una provetta contenente anticoagulante per prevenire la coagulazione del sangue. Aggiungere globuli rossi, globuli rossi, tampone di lisi per lisare i globuli rossi senza intaccare altre cellule del sangue.
Centrifuga per sedimentare le cellule del sangue intatte e più dense dai globuli rossi lisati meno densi, che rimangono nel surnatante. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in un terreno fresco.
Trasferire le cellule su una piastra di coltura. Incubare per consentire ai macrofagi e ai monociti di aderire alla piastra mentre le cellule non aderenti, comprese le cellule B, rimangono in sospensione.
Raccogliere le cellule in sospensione in una nuova provetta. Centrifugare per pellettare le celle e risospenderle in un tampone.
Aggiungere una soluzione cocktail contenente anticorpi biotinilati specifici per le cellule del sangue diverse dalle cellule B. Gli anticorpi si legano agli antigeni sulla superficie delle cellule non B, lasciando le cellule B non marcate.
centrifuga. Eliminare il surnatante contenente anticorpi non legati.
Aggiungere una soluzione di perle magnetiche coniugate con streptavidina. Durante l'incubazione, la streptavidina sulle microsfere si lega strettamente agli anticorpi biotinilati legati alle cellule non B, formando complessi.
Posizionare il tubo in un campo magnetico per far aderire le cellule non B legate alle perline magnetiche alle pareti del tubo, lasciando le cellule B in sospensione. Trasferire il surnatante contenente cellule B pure in una provetta.
Centrifugare e risospendere le cellule B nel terreno per ulteriori analisi a valle.
Immediatamente dopo aver prelevato un campione di sangue da 10 millilitri dalla vena cubitale mediana in una provetta da 15 millilitri contenente EDTA integrato con potassio, capovolgere la provetta più volte per prevenire la formazione di coaguli. Quindi, aggiungere 35 millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi autoclavato alle cellule per un'incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente.
Quando la luce può essere osservata attraverso il tubo, centrifugare il sangue e confermare la presenza di un pellet bianco. Rimuovere il tampone di lisi residuo con 10 millilitri di autoclave a PBS e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno RPMI 1640.
Piastra le cellule in una piastra di coltura di 10 centimetri per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, agitare delicatamente il piatto di coltura alcune volte e trasferire le cellule galleggianti in una provetta conica di plastica da 15 millilitri.
Dopo due lavaggi per centrifugazione, risospendere il pellet a una concentrazione da 5 a 10 x 106 cellule per millilitro in 200 microlitri di tampone PBS freddo e aggiungere 5 microlitri di cocktail di anticorpi anti-umani biotinilati specifici per le cellule del sangue per 1 x 106 cellule.
Dopo un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio, lavare le cellule in un volume di PBS sterile 10 volte in eccesso e risospendere il pellet in 5 microlitri di microsfere coniugate con streptavidina per 1 x 106 cellule per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio. Al termine dell'incubazione, aggiungere 2 millilitri di tampone PBS alle cellule e posizionare la provetta su un supporto magnetico per 8 minuti a temperatura ambiente.
Quando le microsfere si sono attaccate alla parete della provetta, trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta conica e aggiungere altri 2 millilitri di tampone PBS alle cellule. Dopo la seconda raccolta del surnatante, raccogliere le cellule raggruppate mediante centrifugazione e trasferire le cellule in una provetta di polistirene da 5 millilitri in tampone PBS fresco a una concentrazione di 1 x 107 cellule per millilitro.