JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:01 min. • July 8th, 2025
Sulla base dei loro recettori di superficie cellulare, le cellule B circolanti umane sono classificate come cellule B naive CD19-positive, cellule B di memoria CD19 e CD27-positive e plasmablasti CD19, CD27 e CD38-positivi.
Per ordinare queste popolazioni cellulari, prendere una sospensione di cellule B purificata. Incubare con anticorpi umani contro le immunoglobuline G. Gli anticorpi bloccano i recettori Fc delle cellule B, impedendo il legame degli anticorpi non specifici.
Aggiungere anticorpi marcati in fluorescenza che hanno come bersaglio CD19, CD27 e CD38.
Gli anticorpi anti-CD19 si legano ai recettori CD19 espressi ubiquitariamente sulle cellule B.
Gli anticorpi anti-CD27 si legano ai recettori CD27 espressi sulle cellule B di memoria e sulle plasmacellule plasmablastiche.
Gli anticorpi anti-CD38 si legano ai recettori CD38 espressi sulle plasmacellule dei plasmablasti.
Aggiungi un colorante fluorescente legante il DNA come marcatore di cellule morte.
Le cellule morte mostrano una perdita di integrità della membrana, consentendo l'ingresso cellulare del colorante e il legame con il DNA a doppio filamento; le cellule vive rimangono non colorate.
Centrifugare per rimuovere gli anticorpi e i coloranti non legati e risospendere le cellule nel tampone FACS. Filtrare le cellule attraverso un colino per ottenere una sospensione omogenea ed eliminare i grumi.
Utilizzando un citometro a flusso, separare le cellule morte da quelle vive. All'interno delle cellule vive, l'espressione di CD19, CD27 e CD38 distingue le cellule B naive, le cellule B di memoria e le plasmacellule plasmablastiche.
Dopo aver eseguito il blocco aspecifico, aggiungere 1 microgrammo di ciascun anticorpo di selezione per 1 x 106 cellule alla provetta mescolando delicatamente per un'incubazione di 30 minuti su ghiaccio. Durante gli ultimi cinque minuti dell'incubazione, aggiungere 5 microlitri di 7-AAD alle cellule. Quindi, aggiungere 2 millilitri di PBS fresco alle cellule e agitare prima di centrifugare.
Risospendere il pellet in un tampone di selezione fresco a una concentrazione compresa tra 1 e 5 x 107 celle per millilitro e filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 40 micron in un nuovo tubo di polistirene da 5 millilitri. Quindi, smistare le cellule mediante citometria a flusso in tre provette da 15 millilitri contenenti 5 millilitri di terreno RPMI fresco per raccogliere le cellule B naive, le cellule B di memoria e le plasmacellule plasmablastiche.