Valutazione funzionale delle cellule B secernenti anticorpi mediante saggio ELISpot

Le cellule B che secernono anticorpi, o ASC, sono cellule B differenziate che secernono isotipi di anticorpi, tra cui IgG e IgM, per garantire la protezione contro i patogeni.

Per eseguire una valutazione funzionale delle ASC in vitro, iniziare con il test spot di immunoassorbimento enzimatico. Prendi una piastra ELISpot contenente una membrana di fluoruro di polivinilidene attivato alla base.

Incubare i pozzetti con frammenti di anticorpi policlonali contenenti esclusivamente regioni Fab senza la regione Fc dell'anticorpo. Ogni regione Fab ha un sito di legame per specifici isotipi di anticorpi - IgG o IgM, che consente l'identificazione di entrambi gli isotipi.

Durante l'incubazione, i frammenti di anticorpi si attaccano alla membrana, portando all'immobilizzazione.

Sovrapporre i pozzetti con soluzioni bloccanti per evitare legami non specifici. Seminare la piastra con cellule B attivate che secernono anticorpi e incubare. Le ASC secernono diversi isotipi, tra cui IgG e IgM, che si legano ai frammenti di anticorpi legati alla membrana.

Lavare la piastra con un tampone per rimuovere gli anticorpi secreti non legati. Trattare alcuni pozzetti con anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi per le IgM e altri con anticorpi di rilevamento per le IgG e incubare.

Gli anticorpi di rilevazione si legano ai rispettivi isotipi, formando immunocomplessi.

Aggiungere substrati colorimetrici a tutti i pozzetti, che interagiscono con gli enzimi e producono macchie di colore viola sulla membrana. Aggiungere una soluzione di arresto per fermare la reazione.

La macchia colorata prodotta in ciascun pozzetto indica la presenza dell'isotipo dell'anticorpo specifico, correlato all'attività secretoria delle cellule B.

Quando tutte le cellule sono state raccolte, seminare i sottoinsiemi in pozzetti individuali di una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti a una concentrazione da 1 a 10 x 10⁵ cellule per millilitro in terreno RPMI fresco. Successivamente, attivare le cellule B con 5 microgrammi di CpG (ODN 2006) per 1 x 10⁶ cellule per millilitro per pozzetto nell'incubatore di coltura cellulare per cinque giorni.

Al termine dell'attivazione, aggiungere 30 microlitri di etanolo al 35% in acqua distillata a ciascun pozzetto delle piastre ELISpot per 30 secondi. Quindi, sostituire l'etanolo in ogni pozzetto con 150 microlitri di acqua bidistillata autoclavata e incubare le piastre a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere l'etanolo residuo. Eseguire un lavaggio PBS, seguito dall'aggiunta di 50 microlitri del frammento policlonale F(ab')2 di Ig anti-umane a ciascun pozzetto.

Lavare le piastre due volte con PBS, come appena dimostrato. Bloccare il legame aspecifico in ogni pozzetto con 200 microlitri di PBS fresco con BSA per due ore a temperatura ambiente. Dopo un'altra serie di lavaggi PBS, incubare i pozzetti in 100 microlitri di terreno RPMI 1640 fresco a 37 gradi Celsius. Quindi, sostituire il terreno in ogni pozzetto ELISpot con il numero appropriato di cellule B attivate.

Portare il volume finale di ogni pozzetto a 150 microlitri con terreno RPMI fresco. Quindi, rimettere la piastra ELISpot nell'incubatore per colture cellulari per 8-14 ore. Al termine del periodo di incubazione, scartare il terreno e lavare i pozzetti con 200 microlitri di PBS più Tween 20 per cinque lavaggi di 3 minuti.

Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere gli anticorpi di rilevamento appropriati ai pozzetti corrispondenti e incubare le piastre per due ore al buio. Dopo un'altra serie di lavaggi PBS, aggiungere 50 microlitri di substrato BCIP/NBT a ciascun pozzetto per 5-15 minuti a temperatura ambiente.

Quando compaiono macchie viola, interrompere la reazione con 100 microlitri di acqua distillata doppia per pozzetto e sciacquare la piastra con acqua corrente del rubinetto. Quindi, asciugare all'aria le membrane ELISpot al riparo dalla luce.