Isolamento di leucociti epatici marginanti da un fegato di topo

I leucociti epatici marginanti, MH, si trovano aderenti alle pareti dei vasi sanguigni epatici specializzati o sinusoidi, che sono rivestiti da cellule endoteliali. I leucociti MH vengono reclutati nel tessuto circostante in risposta all'infiammazione.

Per raccogliere i leucociti MH, inizia con un topo soppresso in posizione supina. Incidere le cavità peritoneale e toracica, esponendo il fegato e il complesso cardiopolmonare.

Spostare l'intestino per esporre la vena porta, che trasporta il sangue dalla milza, dal tratto gastrointestinale e dagli organi associati al fegato. Inserire un ago collegato a una pompa peristaltica nella vena porta.

Sezionare la vena cava inferiore, un importante vaso sanguigno che trasporta il sangue deossigenato dal fegato al cuore, per raccogliere il perfusato durante la perfusione.

Perfondere il fegato attraverso la vena porta con tampone contenente anticoagulante a bassa velocità di flusso per un breve periodo. Questo passaggio aiuta a rimuovere il sangue con cellule non aderenti dai vasi sanguigni del fegato attraverso il deflusso inferiore della vena cava. Scartare questo perfusato contaminato dal sangue.

Ora, perfondere a una portata più elevata. La perfusione forzata ad un aumento del flusso e della velocità di taglio interrompe l'adesione tra i leucociti MH e il rivestimento interno dei vasi sanguigni, staccando così i leucociti MH dalla parete sinusoidale.

Raccogliere e trasferire il perfusato contenente MH, leucociti e altre cellule del sangue in una nuova provetta. Centrifuga. Risospendere il pellet contenente leucociti MH per ulteriori analisi a valle.

Per raccogliere i leucociti marginanti epatici di topo, immediatamente dopo la cessazione della respirazione, utilizzare forbici sterili e pinze per tessuto dentale per praticare un'incisione addominale sulla linea mediana fino al processo xifoideo. Quindi, usa la pinza per sollevare lo sterno e taglia con cura il diaframma e la gabbia toracica su entrambi i lati.

Bloccare un emostatico sullo sterno e piegare la gabbia toracica rostralmente per esporre il complesso cardiopolmonare. Spostare l'intestino al di fuori della cavità addominale a sinistra dell'animale, esponendo la vena porta. Quindi, collegare un ago calibro 30 a una pompa peristaltica e inserirlo nella vena porta, rostrale alla vena splenica.

Tagliare la vena cava inferiore sopra il diaframma per consentire il drenaggio e la raccolta del perfusato dalla cavità toracica. Quindi, accendere la pompa peristaltica a una velocità di circa 3 millilitri al minuto e raccogliere i primi millilitri di perfusato contaminato dal sangue dalla piscina della cavità toracica. Dopo aver raccolto 3 millilitri, spegnere la pompa.

Quindi, dopo aver inserito un ago a farfalla calibro 21 collegato a una siringa da 10 millilitri, riavviare la perfusione a una velocità fino a 4 millilitri al minuto fino a quando non vengono raccolti 10 millilitri di perfusato dalla cavità toracica. Quando il fegato diventa marrone chiaro, terminare la perfusione. Quindi, trasferisci il perfusato in un tubo da 15 millilitri. Centrifugarlo e poi aspirare il surnatante.