Riconoscimento del marcatore CD di cellule killer umane indotte da citochine mediante citometria a flusso

Le cellule CIK (Cytokine-induced Killer) sono popolazioni di cellule immunitarie eterogenee generate ex vivo da colture di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) stimolate con citochine specifiche e anticorpi monoclonali. Le cellule CIK comprendono popolazioni cellulari, tra cui le cellule NK-T CD3+CD56+, le cellule T CD3+CD56- e le cellule NK CD3-CD56+.

Per determinare la proporzione delle cellule CIK, iniziare con provette contenenti una sospensione cellulare CIK derivata da PBMC. Aggiungere gli anticorpi anti-CD3 e anti-CD56 coniugati a diversi fluorofori e la loro miscela alle provette designate. Aggiungere anticorpi di controllo dell'isotipo coniugati a fluorofori simili come anticorpi specifici in altre provette.

Gli anticorpi anti-CD3 e anti-CD56 marcati con fluorescenza riconoscono e si legano rispettivamente a CD3 e CD56 espressi su popolazioni di cellule CIK. Gli anticorpi di controllo dell'isotipo non sono specifici dell'antigene bersaglio, facilitando le misurazioni del segnale di fondo non specifico.

Pipettare le cellule in provette a fondo tondo con cappucci per filtri cellulari, che aiutano a rimuovere gli aggregati cellulari. Caricare le provette in un carosello del citometro a flusso. Durante la corsa, ogni cellula passa attraverso il canale e incontra i raggi laser, disperdendo la luce.

Un rivelatore misura l'intensità della luce diffusa in avanti, indicativa delle dimensioni della cella; un altro misura l'intensità della luce diffusa laterale perpendicolarmente al raggio laser, indicativo della granularità cellulare. Insieme, queste informazioni aiutano a identificare la popolazione di cellule immunitarie.

Contemporaneamente, raggi laser di specifiche lunghezze d'onda di eccitazione eccitano gli anticorpi coniugati con fluorofori sulle cellule, provocando emissioni di segnali fluorescenti che vengono rilevati.

L'analisi di specifiche intensità fluorescenti sulle cellule determina la proporzione di sottopopolazioni di cellule CIK.

Iniziare questa procedura con la preparazione delle cellule CIK, come descritto nel protocollo di testo. Quindi, lavare le cellule CIK con 10 millilitri di PBS sterile. Centrifugare per 10 minuti a 300 volte g e da 18 a 20 gradi Celsius. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 5 millilitri di PBS. Contare il numero di cellule e testare la vitalità delle cellule utilizzando il saggio di esclusione del blu di tripano.

Aliquotare le cellule CIK in sei provette sterili da 1,5 millilitri a una densità di circa 0,5-1 milione di cellule per millilitro di PBS. Etichettare e trattare le cellule, come descritto nel protocollo di testo. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi pipettando delicatamente su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da 1 millilitro. Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.

Centrifugare le provette per 10 minuti a 300 volte g e da 18 a 20 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 millilitro di PBS. Quindi, pipettare delicatamente le cellule su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da 1 millilitro. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile di polistirene da 5 millilitri a fondo tondo con tappo per filtro cellulare, pipettando delicatamente attraverso il tappo. Quindi, posizionare i tubi sulla giostra in ordine.

Aprire il software di analisi della citometria a flusso e creare una cartella sperimentale. Quindi, fai clic sul pulsante "Nuovo campione" per aggiungere un campione e una provetta all'esperimento. Assegnare un nome ai tubi come elencato nel protocollo di testo.

Per creare un sistema di scattergating per le popolazioni cellulari CIK, selezionare prima il tubo 1 e fare clic sul pulsante Dot Plot per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegna un gate rettangolare sull'intera popolazione cellulare con una soglia FSC-A maggiore di 5.000 per escludere i detriti cellulari.

Selezionare il parametro FSC-A/FSC-H per il nuovo grafico a punti e disegnare un gate poligonale attorno a tutte le singole celle. Selezionare il parametro conteggio rispetto a FITC coniugato (CD3) e conteggio rispetto a APC coniugato (CD56) per il nuovo grafico dell'istogramma. Selezionare il parametro coniugato FITC (CD3) rispetto a quello coniugato APC (CD56) per il nuovo grafico a punti e disegnare una porta a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni.

Registra i dati di 20.000 singole cellule in ogni campione. Fare clic sul pulsante "Carica campione" per analizzare prima il campione di controllo vuoto. Identificare l'intera popolazione di cellule CIK utilizzando i parametri dei canali CD56 e CD3. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di cellule CIK e ristamparli in file di analisi.