Saggio per l'identificazione della secrezione di interferone-gamma negli organi linfoidi murini

L'interferone-gamma, o IFN-γ, una citochina secreta dai linfociti T e dalle cellule natural killer o NK, media la risposta immunitaria contro gli agenti patogeni.

Per studiare la produzione in situ di IFN-γ, prendiamo un topo trapiantato con cellule T marcate in fluorescenza ingegnerizzate per esprimere un recettore che riconosce l'ovoalbumina, un antigene modello.

Prendi una sospensione di batteri patogeni – geneticamente modificati per esprimere l'ovoalbumina – e iniettala per via endovenosa nel topo, causando un'infezione sistemica. I batteri circolanti raggiungono la milza, un organo linfoide secondario, che aiuta la rimozione degli agenti patogeni facilitando l'interazione con le cellule immunitarie.

Le cellule che presentano l'antigene inghiottono i batteri e mostrano l'antigene. Le cellule T si legano all'antigene attraverso il suo recettore, vengono attivate e producono IFN-γ.

Le cellule macrofagiche, infettate dai batteri, rilasciano mediatori immunitari e sovraregolano i ligandi attivanti sulla loro superficie. Dopo l'interazione con questi segnali, le cellule NK si attivano e producono IFN-γ.

Iniettare un inibitore del trasporto proteico intracellulare per limitare la secrezione di IFN-γ, causandone l'accumulo intracellulare.

Raccogli la milza del topo. Fissare il tessuto e congelarlo per facilitare il sezionamento. Utilizzando un crio-microtomo, generare sottili sezioni di tessuto e posizionarle su vetrini. Aggiungere gli anticorpi specifici delle cellule NK, che si legano ai marcatori di superficie, e gli anticorpi specifici dell'IFN-γ, che colorano l'IFN-γ intracellulare. Questi anticorpi sono marcati con diversi fluorofori.

Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l'IFN-γ all'interno delle cellule NK e delle cellule T.

Scartare la soluzione fissativa e aggiungere 5 millilitri di PBS per 5 minuti a temperatura ambiente, agitando delicatamente. Quindi, sostituire il PBS con 5 millilitri di saccarosio al 30% e incubare per 12-24 ore per mantenere la morfologia del tessuto. Ora, l'organo affonda sul fondo della piastra.

Per congelare il campione, mettere il ghiaccio secco in un recipiente grande e posizionare un recipiente più piccolo all'interno, contenente circa 50 millilitri di metanolo puro e alcuni pezzi di ghiaccio secco. Asciugare delicatamente la milza con un panno privo di lanugine. Far gocciolare una goccia di composto OCT sul fondo dello stampo di base e posizionare la milza all'interno dello stampo. Fare attenzione a non produrre bolle.

Aggiungere circa 1 millilitro di OCT sulla milza. Con una pinza, depositare lo stampo di base sulla superficie del metanolo nel bagno di ghiaccio secco, assicurandosi che il metanolo non tocchi l'OCT. L'OCT si addenserà e diventerà bianco una volta congelato. Ricorda di congelare il tessuto il più rapidamente possibile per ridurre al minimo gli artefatti.

Su un crio-microtomo, impostato alla temperatura di meno 21 gradi Celsius. Sezionare il tessuto allo spessore desiderato di circa 10 micrometri. Utilizzare un pennello per raccogliere le sezioni sui vetrini del microscopio e ispezionarle visivamente. Lasciare che le sezioni raggiungano la temperatura ambiente.

Disegna un cerchio con un bloccante di liquidi, ad esempio una penna PAP, attorno alla sezione di tessuto all'esterno dell'OCT. Una volta che il tessuto si è asciugato, reidratare il campione facendo gocciolare 100 microlitri di PBS sulla sezione di tessuto per 5 minuti. Quindi, rimuovere il PBS dalla sezione mediante aspirazione e aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante per sezione del campione. Incubare in una camera umida coperta per un minimo di un'ora a temperatura ambiente.

Per colorare con gli anticorpi primari, sostituire la soluzione bloccante con la miscela di anticorpi primari preparata per ciascun campione. Incubare per quattro ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 gradi Celsius in una camera umida coperta, prima di lavare secondo il manoscritto.

Ora, diluire gli anticorpi secondari di interesse a una concentrazione ottimale, di solito 2,5 microgrammi per millilitro nella soluzione bloccante. Rimuovere la soluzione di lavaggio finale dalla sezione e aggiungere la miscela di anticorpi secondari preparata sopra la sezione e incubare per una o quattro ore a temperatura ambiente in una camera coperta e umida.

Dopo il lavaggio con tampone di lavaggio secondo il manoscritto, rimuovere la soluzione di lavaggio ed eseguire un lavaggio finale con PBS. Aspirare la soluzione salina tamponata con fosfato e lasciare evaporare il PBS rimanente senza che la sezione si asciughi completamente.

Disegna un cerchio attorno alla sezione sul retro della diapositiva. Quindi, posizionare una goccia del mezzo di montaggio sopra il campione, assicurandosi che il mezzo copra l'intera sezione, e posizionare con cura un vetro di copertura sulla parte superiore. Lasciare polimerizzare i campioni per una notte a temperatura ambiente al buio.

Al mattino, posizionare il vetrino sotto un microscopio a scansione laser spettrale invertito. Regolare gli obiettivi a 10x/NA 0,40 o 60x/NA 1,4 per l'analisi della localizzazione subcellulare delle citochine.