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Immunologia
0 visualizzazioni • 4:25 min • July 8th, 2025
I tubuli seminiferi dei testicoli contengono cellule di Sertoli, che nutrono le cellule germinali. Le cellule di Sertoli sono collegate tramite giunzioni strette e sono saldamente attaccate alla matrice basale ricca di acido ialuronico. Questa disposizione delle cellule di Sertoli regola l'ingresso delle cellule immunitarie nel tubulo e protegge le cellule germinali in via di sviluppo dalla degradazione.
Per isolare le cellule di Sertoli, iniziare con una provetta contenente tubuli seminiferi parzialmente digeriti derivati da testicoli di topo. Questi tubuli mancano di cellule peritubulari, cellule muscolari lisce che circondano i tubuli seminiferi.
Trattare i tubuli con un cocktail enzimatico contenente ialuronidasi - essenziale per l'idrolisi dell'acido ialuronico - e DNasi.
Le ialuronidasi entrano nei tubuli e scindono l'acido ialuronico – un polisaccaride basale – avviando il distacco delle cellule di Sertoli dalla matrice basale e rilasciando le cellule germinali nella soluzione. La DNasi digerisce tutti i contaminanti del DNA dalla soluzione, prevenendo l'aggregazione cellulare.
Lavare i tubuli digeriti enzimaticamente con un tampone, rimuovendo gli enzimi residui, i frammenti cellulari e le cellule germinali. Risospendere i tubuli digeriti e caricare la sospensione in un gruppo ago-siringa.
Passare ripetutamente la soluzione per creare un taglio idrodinamico e interrompere le giunzioni strette delle cellule di Sertoli, rilasciandole come singole cellule insieme alle cellule germinali rimanenti.
Filtrare la sospensione cellulare, rimuovendo i detriti cellulari e ottenendo una sospensione a cella singola. Centrifugare il filtrato per pellettizzare le celle.
Risospendere le cellule in un terreno di crescita privo di siero per l'espansione selettiva delle cellule di Sertoli.
Per isolare le cellule di Sertoli, utilizzare una nuova pipetta da 25 millilitri per risospendere accuratamente i tubuli sedimentati in 25 millilitri di PBS. Dopo aver lasciato riposare i tubuli per altri 12 minuti, utilizzare la stessa pipetta per lavare i tubuli altre tre volte allo stesso modo. Quindi, trasferire i tubuli in un nuovo flacone con tappo a vite da 100 millilitri e aggiungere la soluzione di ialuronidasi-DNasi-I. Inoltre, digerire i tubuli in un bagno d'acqua agitante a 32 gradi Celsius per cinque minuti.
Controllare un'aliquota della sospensione mediante ispezione al microscopio ottico con ingrandimento 100x. Dovrebbero essere visibili tubuli corti, aggregati tubulari e cellule rilasciate. Lasciare riposare gli aggregati tubolari per 10 minuti. Quindi, utilizzare una nuova pipetta da 25 millilitri per rimuovere il surnatante e lavare gli aggregati quattro volte in 25 ml di PBS, con 10 minuti di sedimentazione tra ogni lavaggio.
La popolazione di PTC contaminante sarà stata ridotta. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 20 ml di terreno RPMI 1640 alle cellule e passare la sospensione attraverso un ago da 18 G montato su una siringa da 20 millilitri per 10 volte. Successivamente, confermare rapidamente che tutti gli aggregati sono stati dissociati e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron per ottenere una sospensione unicellulare pura.
Centrifugare il filtrato utilizzando la pipetta da 25 millilitri per aspirare con cura il surnatante. Quindi, risospendere le cellule di Sertoli isolate in 40 ml di terreno RPMI 1640 privo di siero. Quindi, contare il numero di cellule vitali mediante esclusione del tripano-blu e regolare la concentrazione cellulare a 3 x 106 cellule per millilitro. Infine, alimentare 1 millilitro di cellule per pozzetto in una piastra a sei pozzetti.