Isolamento selettivo di cellule T CD4⁺ Vδ1⁺ γδ da cellule mononucleate del sangue periferico umano

Le cellule T γδ esprimono i recettori delle cellule T, TCR, che comprendono catene gamma e delta con domini variabili e costanti.

Le cellule T CD4+ Vδ1+ - una sottopopolazione di cellule T γδ - co-esprimono la catena Vδ1 variabile e il co-recettore CD4. Queste cellule migrano nei tessuti infiammati e si transdifferenziano in cellule T CD4+ o CD8+ αβ funzionalmente mature, mediando una risposta immunitaria.

Per isolare le cellule T CD4+ Vδ1+ dalle cellule mononucleate del sangue periferico umano, le PBMC riprospendano le cellule in un tampone. Utilizzare un reagente che blocca l'Fc per bloccare i recettori Fc sulla superficie cellulare e prevenire il legame di anticorpi non specifici.

Aggiungere anticorpi anti-Vδ1 coniugati con il fluoroforo FITC, che si legano agli antigeni Vδ1 delle cellule T γδ. Incubare con microsfere magnetiche accoppiate ad anticorpi anti-FITC, che si legano al colorante FITC sugli anticorpi legati alle cellule T Vδ1.

Far passare la miscela attraverso una colonna magnetica per attirare le cellule T Vδ1+ legate a microsfere; le cellule T Vδ1- rimangono non legate e vengono successivamente espulse. Lavare con forza la colonna spingendo il tampone attraverso di essa per staccare le cellule T Vδ1+.

Incubare le cellule con perle magnetiche rivestite di anticorpi anti-CD4, che si legano al co-recettore CD4 delle cellule. Posizionare la provetta in un magnete per attirare le cellule T CD4+ Vδ1+ legate alla perlina; le cellule T CD4- Vδ1+ rimangono non legate.

Risospendere le cellule T CD4+ Vδ1+ in un terreno. Aggiungere un reagente che stacca le microsfere per rilasciare le perle dalle cellule. Riposizionare il tubo sul magnete per separare le perline.

Raccogliere il surnatante cellulare CD4+ Vδ1+ per ulteriori analisi.

Prima di iniziare l'isolamento delle cellule T Vδ1, utilizzare un'aliquota 1 x 10⁶ di PBMC per valutare la frequenza delle cellule T Vδ1CD4-positive nel campione del donatore mediante citometria a flusso. Quindi, centrifugare il resto dei linfociti e risospendere il pellet in 60 microlitri di tampone MACS per 1 x 10⁷ cellule.

Successivamente, bloccare le cellule in 20 microlitri di reagente bloccante Fc per 1 x 10⁷ cellule, seguito dall'aggiunta di 10 microlitri di anticorpo Vδ1 anti-umano coniugato FITC per 1 x 10⁷ cellule per 12 minuti a 4 gradi Celsius al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in 14 millilitri di tampone MACS.

Risospendere il pellet in 80 microlitri di tampone MACS per 1 x 10⁷ celle e aggiungere 20 microlitri di microsfere anti-FITC per 1 x 10⁷ celle con miscelazione. Dopo 15 minuti al buio a 4 gradi Celsius, lavare le cellule in 10 millilitri di tampone MACS fresco.

Durante la centrifugazione, equilibrare una colonna magnetica pre-raffreddata con 500 microlitri di tampone MACS. Quindi, risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone MACS e aggiungerle con cura alla parte superiore della colonna.

Sciacquare la colonna con tre lavaggi tampone MACS da 500 microlitri. Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e utilizzare uno stantuffo per lavare rapidamente le celle Vδ1-positive con 1 millilitro di tampone MACS in un tubo conico da 15 millilitri.

Dopo aver fatto passare le cellule attraverso una seconda colonna, vorticare 25 microlitri di perle CD4 per 30 secondi. Quindi, trasferire le perle in una provetta di reazione da 1,5 millilitri, contenente 1 millilitro di tampone MACS, e posizionare la provetta su un magnete.

Dopo 1 minuto, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare con cura il surnatante e risospendere le perle in 25 microlitri di tampone MACS. Quindi, far girare le cellule Vδ1-positive isolate e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone MACS. Mescolare energicamente le cellule con le perline. Quindi, dopo 20 minuti a 4 gradi Celsius, con inclinazione costante, riposizionare il tubo sul magnete.

Per evitare la perdita di volume del campione e ridurre al minimo la presenza di cellule CD4-negative contaminanti, è essenziale pipettare il tampone rimanente dall'interno del coperchio nella fiala.

Dopo due minuti, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per trasferire il surnatante contenente cellule Vδ1-positive CD4-negative in una nuova provetta. Quindi, rimuovere le cellule CD4-positive dal magnete e risospenderle in 500 microlitri di tampone MACS.

Dopo aver rimosso le cellule CD4-negative altre due volte, come appena dimostrato, incubare le cellule CD4-positive in 100 microlitri di terreno di coltura e 10 microlitri di soluzione di distacco delle perle a temperatura ambiente per 45 minuti con inclinazione costante. Al termine dell'incubazione, rimettere le cellule nel magnete per 1 minuto e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per trasferire il surnatante contenente cellule CD4-positive Vδ1-positive senza microsfere in una nuova provetta.

Dopo aver rimosso le perline rimanenti altre due volte, come appena dimostrato, centrifugare le celle. Quindi, risospendere le cellule CD4-positive Vδ1-positive in un terreno fresco e preriscaldato per il conteggio.