Isolamento della rete di cellule immunitarie gengivali da blocchi di denti murini

La gengiva, o tessuto gengivale, circonda la porzione cervicale dei denti e l'osso mascellare.

Il tessuto gengivale comprende uno strato di epitelio, separato dal tessuto connettivo sottostante da una membrana basale ricca di collagene IV. Il tessuto connettivo gengivale contiene una rete di cellule immunitarie, tra cui linfociti, mastociti e neutrofili che proteggono la gengiva dalle infezioni.

Per isolare la rete di cellule immunitarie gengivali, prelevare blocchi di denti murini contenenti tessuto gengivale saldamente attaccato. Trattare i blocchi con un cocktail enzimatico, contenente collagenasi di tipo quattro e DNasi.

Le collagenasi entrano nel tessuto, degradano il collagene-IV e interrompono la membrana basale e l'epitelio gengivale, causando l'allentamento della gengiva dai denti. Nel frattempo, le DNasi degradano i contaminanti del DNA. Aggiungere un agente chelante al tubo; per rimuovere i cationi bivalenti e prevenire l'aggregazione cellulare.

Trasferire i blocchi di denti digeriti in una capsula di Petri contenente terreno DNasi. Estrarre il tessuto gengivale dai blocchi dentali e trasferirlo in un colino cellulare.

Usando uno stantuffo, schiaccia il fazzoletto. Questa dissociazione meccanica interrompe lo strato connettivo gengivale, rilasciando le cellule immunitarie dal tessuto. Lavare il colino con il terreno e raccogliere le cellule rilasciate nel filtrato.

Centrifugare il filtrato, pellettizzando le cellule, ed eliminare il surnatante contenente enzimi e detriti residui. Risospendere la popolazione cellulare che trasporta cellule immunitarie in un terreno completo, pronto per analisi future.

Eliminare il tessuto in eccesso dal bordo della gengiva e trasferire i blocchi mascellare e mandibolare in un tubo conico da 50 millilitri contenente 5 millilitri di collagenasi e DNasi su ghiaccio. Digerire il tessuto in un'incubatrice shaker a 37 gradi Celsius per 1 ora, aggiungendo 50 microlitri di EDTA 0,5 molari negli ultimi cinque minuti. Quindi, aggiungere 5 millilitri di terreno DNasi freddo ai tessuti e mescolare delicatamente il contenuto della provetta facendo roteare. Quindi, trasferire i quattro blocchi di tessuto in una capsula di Petri e coprirli con 500 microlitri di terreno DNasi fresco.

Usa un bisturi per rimuovere la gengiva da ogni blocco di tessuto e trasferisci l'intero contenuto del piatto in un colino cellulare da 70 micron sopra un tubo da 50 millilitri. Lavare la piastra di Petri e il colino con 3-5 millilitri di terreno DNasi fresco, quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa sterile da 3 millilitri per schiacciare il tessuto gengivale contro la rete del colino. Sciacquare il colino con 30-35 millilitri di mezzo DNasi freddo e centrifugare il filtrato. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di terreno completo e determinare il numero di celle vitali.