Visualizzazione intravitale dei linfociti intraepiteliali gamma delta

I

linfociti intraepiteliali gamma delta, γδ IEL, sono cellule T migratorie specializzate che esprimono recettori delle cellule T gamma delta. Queste cellule si trovano prevalentemente all'interno dell'epitelio intestinale e pattugliano l'epitelio per limitare la traslocazione dei patogeni nell'intestino.

Per visualizzare i γδ EIL all'interno di un organismo vivente, iniziare con un topo transgenico anestetizzato con un intestino tenue parzialmente esposto. Il topo transgenico è geneticamente modificato per esprimere proteine reporter – proteine fluorescenti verdi potenziate – esclusivamente in γδ IEL, consentendone il tracciamento.

Utilizzando un elettrocauterizzazione, creare una linea di perforazione sull'intestino tenue esposto lungo la superficie anetimesenterica, prevenendo un sanguinamento eccessivo.

Praticare un'incisione longitudinale sulla linea di perforazione per esporre la mucosa intestinale, mostrando più proiezioni simili a dita: villi. Ogni villo contiene cellule epiteliali con γδ EIL residenti che sporgono nel lume intestinale.

Posizionare il mouse con la superficie mucosa esposta direttamente a contatto con il colorante fluorescente, conferendo fluorescenza rossa al lume.

Immagine del topo al microscopio confocale. Individua un villo e un'immagine su diversi piani focali lungo l'asse z, partendo dall'epitelio della punta del villo. Combina queste sezioni ottiche per produrre un'immagine 3D.

L'imaging intravitale mostra il movimento dinamico dei γδ IEL a fluorescenza verde lungo la membrana basale della cellula epiteliale vicino al lume rosso.

Posizionando due paia di pinze su entrambi i lati del mesentere sottostante tra i vasi sanguigni, strofinare delicatamente le punte delle pinze insieme per creare un foro nella membrana. Utilizzando una pinza angolata e un ago curvo a punta conica attaccato a una sutura di 5 centimetri, penetrare un lato del peritoneo attraverso il foro nella membrana e verso l'alto attraverso l'altro lato del rivestimento peritoneale, posizionando una sutura nella parte superiore e un'altra vicino alla parte inferiore dell'incisione per chiudere l'incisione mantenendo l'ansa dell'intestino esternalizzata.

Per aumentare le probabilità di successo, non legare o strappare i vasi sanguigni durante il posizionamento della struttura addominale e limitare qualsiasi manipolazione estranea dell'intestino.

Quindi, chiudere la pelle sotto l'ansa intestinale allo stesso modo, posizionando una sutura al centro dell'incisione tra le suture precedenti nel peritoneo sottostante. Utilizzando un elettrocauterizzazione, tracciare una linea di perforazione lungo il bordo anti-mesenterico e applicare immediatamente alcune gocce d'acqua sulla superficie dell'intestino per prevenire ulteriori danni ai tessuti indotti dal calore.

Tamponare con un Kimwipe per rimuovere l'acqua residua. Usa le forbici di Vannas per tagliare una fessura orizzontale di circa 1,5 centimetri sul bordo distale del tessuto cauterizzato, lungo la lunghezza della linea cauterizzata verso l'estremità prossimale del segmento di tessuto esternalizzato. Quando la superficie della mucosa è esposta, coprire l'addome con un Kimwipe umido per mantenere il tessuto idratato.

Per l'imaging al microscopio confocale a disco rotante, trasportare il mouse al microscopio in un recipiente coperto. Avvia il software di imaging, inclina la testa del microscopio all'indietro e aggiungi 150 microlitri di colorante AlexaFluor da 1 micromolare nella soluzione salina tamponata di Hank sul fondo in vetro. Posizionare il mouse in modo che la superficie mucosa aperta entri in contatto diretto con il vetrino coprioggetti.

Posizionare il mouse e la parabola sul tavolino di imaging in un'incubatrice preriscaldata. Impostare l'intensità di eccitazione e il tempo di esposizione per ciascun laser rispettivamente su non più di 10-15 milliwatt e tra 120 e 150 millisecondi e regolare la media dei fotogrammi su "2".

Attiva la funzione di guadagno di moltiplicazione degli elettroni per ridurre il rumore di fondo e seleziona la calibrazione dell'obiettivo 63X per garantire una misurazione corretta della dimensione dei pixel. Utilizzando il laser a 405 nanometri e l'obiettivo ad aria 20x, visualizza manualmente i nuclei per individuare un campo di villi che manca di movimento o deriva evidente, evitando aree di movimento artefatto dovute alla respirazione, alla peristalsi o al battito cardiaco.

Utilizzando la scansione XY, registrare la coordinata x-y del campo di interesse e passare all'obiettivo 63X a immersione in glicerolo. Acquisisci un'immagine dal vivo sul canale a 405 nanometri per un massimo di 1 minuto per confermare che i villi nel campo selezionato siano stabili, regolando la messa a fuoco per trovare il piano ortogonale appena sotto la punta del villo.

Quindi, acquisire Z-stack partendo da appena sotto l'epitelio della punta dei villi, da circa 15 a 20 micrometri, fino ai villi, fino a quando non è difficile risolvere i nuclei utilizzando incrementi di 1,5 micrometri. Da 3 a 5 minuti dopo l'inizio dell'acquisizione, confermare la stabilità dell'immagine e la motilità delle cellule intraepiteliali gamma-delta e continuare ad acquisire immagini per 30-60 minuti per ogni campo di villi.